摘要
由于基于磁珠的核酸純化的易用性和可擴(kuò)展性，其是過濾和離心方法的更好替代方法。磁珠懸浮液的顆粒性質(zhì)和高粘度使得研究人員難以使用傳統(tǒng)的吸頭移液器對(duì)其進(jìn)行移液。此外，為避免磁珠殘留和交叉污染，使用接觸式移液還會(huì)增加移液吸頭消耗，從而導(dǎo)致高運(yùn)營(yíng)成本和塑料浪費(fèi)。我們?cè)诖私榻B一種改進(jìn)的半自動(dòng)化工作流程，使用 MANTIS® 搭配 Blue®Washer 純化核酸，解決了傳統(tǒng)移液的痛點(diǎn)。
 
介紹
 基于磁珠的提取方法采用簡(jiǎn)單的結(jié)合-洗滌-洗脫過程來分離和純化核酸。 當(dāng)添加磁珠時(shí)， 磁珠可逆地結(jié)合到感興趣的分子上，將其從液相中移除。含有未結(jié)合雜質(zhì)的剩余液體，可以通過清洗磁珠進(jìn)行有效地去除。結(jié)合的純化核酸可用于下游加工。對(duì)于傳統(tǒng)的聚合物或無機(jī)磁珠，液相與磁珠的分離依賴于通過離心使磁珠沉降。
 
由于磁 (Mag) 珠具有超順磁性核心，可在外部磁場(chǎng)中被磁化，因而可以使用永磁體取代離心機(jī)將其制成顆粒。這樣的主要優(yōu)勢(shì)是在磁場(chǎng)被移除之前，珠粒能夠保持固定，而且簡(jiǎn)化了移液并使過程更加自動(dòng)化。
 
磁珠的大小范圍從幾納米到幾微米不等。由于磁珠大小與核心密度相聯(lián)系，所以磁珠懸浮液不穩(wěn)定。為了解決這個(gè)問題，在粘性液體中放入磁珠，以保持它們懸浮并防止在使用過程中快速沉淀。高粘度穩(wěn)定劑會(huì)造成磁珠難以被移液，這是因?yàn)樗鼈儠?huì)粘在移液吸頭上并需要液體類別優(yōu)化。在磁珠分液過程中，傳統(tǒng)的基于移液吸頭的移液器可能會(huì)導(dǎo)致磁珠體積不均勻，從而影響產(chǎn)量。同時(shí)，移液過程中的接觸會(huì)造成洗滌步驟中的高殘留量或微珠損失，從而降低純度或產(chǎn)量。同樣，為避免微珠殘留和交叉污染，接觸式移液過程的每個(gè)步驟都需要一套干凈的移液吸頭，這會(huì)增加吸頭消耗、運(yùn)營(yíng)成本和塑料浪費(fèi)。
 
我們概述了半自動(dòng)、非接觸式和無移液吸頭的 DNA 清理工作流程，在此過程中我們使用 MANTIS 分配 AMPure XP 珠子（Beckman Coulter，目錄號(hào) A63880）以及使用 BlueWasher 進(jìn)行清洗步驟，有效解決了上述限制。
 
儀器
 MANTIS®
 
MANTIS 是一種非接觸式高精度分液器，其死體積很低（圖 1）。這些關(guān)鍵功能由稱為“芯片”（表 1 中的規(guī)格）的獨(dú)特微流體泵實(shí)現(xiàn)。低容量 (LV) 和高容量 (HV) 芯片可以使用移液器吸頭作為輸入源來對(duì)價(jià)格昂貴的試劑進(jìn)行分液。
   
MANTIS 的芯片可以處理高達(dá) 25 厘泊 (cP) 的液體，相當(dāng)于室溫 (RT) 下 70% 的甘油溶液 [1]。與平均 AMPure 微珠 (1 μm) 相比，處理這種粘度和芯片流體通道 (380 μm) 直徑的能力能讓微珠均勻分配到多孔板上。此外，MANTIS 可以防止微珠沉降，因?yàn)橹樽涌梢詮姆胖迷趽u床/旋轉(zhuǎn)容器上的離心管中分配，以實(shí)現(xiàn)均勻懸浮。
 
MANTIS 軟件的一個(gè)獨(dú)特功能是內(nèi)置的濃度歸一化向?qū)�。它即時(shí)執(zhí)行必要的計(jì)算，從讀板機(jī)導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)輸出。  
Blue®Washer 
 BlueWasher 是一種非接觸式、無移液吸頭大體積液體分液器和微孔板清洗機(jī)（圖 2）。通過針頭歧管添加流體以進(jìn)行清洗，而液體排空則通過離心技術(shù)而非吸液來完成。微量滴定板位于對(duì)稱轉(zhuǎn)子中，孔朝外以排出液體。板繞水平軸旋轉(zhuǎn)，液體通過離心力從孔中去除，通過被動(dòng)排水管離開轉(zhuǎn)子室。對(duì)于磁珠 DNA 清理，磁性載體在液體離心抽空過程中保留磁珠。離心排空可減少殘留體積（0.01 μL/孔）和細(xì)胞/微珠洗滌過程中的變異性。 與 MANTIS 和 BlueWasher 的組合（圖 3）相比，我們展示了使用多通道移液器進(jìn)行基于磁珠的 DNA 清理。   
我們計(jì)劃的工作流程展示了可以合并 MANTIS 和 BlueWasher 的步驟。

1.  使用 MANTIS 將 AMPure 微珠分配到樣品板的每個(gè)孔中。
2.  放入微珠并使用 BlueWasher 排空上清液。
3.  使用 BlueWasher 清洗微珠兩次。
4.  使用 MANTIS 向每個(gè)孔中添加洗脫緩沖液。
5.  用傳統(tǒng)的移液器轉(zhuǎn)移洗脫樣品。
6.   DNA 量化后，使用 MANTIS 執(zhí)行濃度歸一化。

 
總結(jié)
 磁珠是提取和純化核酸的有效手段。傳統(tǒng)的移液可能會(huì)導(dǎo)致磁珠的分配不均勻，從而導(dǎo)致缺乏重現(xiàn)性。相反，MANTIS 精確分配高粘度液體的能力能夠均勻分配磁珠。使用 BlueWasher 通過離心排出液體來清洗珠子可防止珠子殘留并最大限度地減少殘留體積（至 10 nL /孔）。此外，這兩種產(chǎn)品的無移液吸頭技術(shù)降低了運(yùn)營(yíng)成本和塑料浪費(fèi)。此外，MANTIS 的濃度歸一化向?qū)нM(jìn)一步簡(jiǎn)化了工作流程。
 
總體而言，此工作流程僅保留一個(gè)傳統(tǒng)的移液步驟來轉(zhuǎn)移洗脫的樣品，從而節(jié)省了約 500 個(gè)吸頭/微孔板。動(dòng)手時(shí)間和技巧成本減少了 83%（表 2）。雖然我們以手動(dòng)移液為例說明了非接觸式工作流程的好處，但在由傳統(tǒng)液體處理程序自動(dòng)化的基于磁珠的工作流程中，可以預(yù)期類似的成本降低。  
致謝
我們要感謝 BlueCatBio 的 Frank Feist 在開發(fā)本應(yīng)用說明時(shí)提供的支持。BlueCatBio 的成立宗旨是“干凈的數(shù)據(jù)等于有前途的藥物發(fā)現(xiàn)。” Blue®Washer 是 BlueCatBio 的注冊(cè)商標(biāo)；欲了解更多信息，請(qǐng)?jiān)L問 www.bluecatbio.com。