非酒精性脂肪肝（NASH）正迅速成為肝移植和肝衰竭的首要原因。肝炎是NASH的關(guān)鍵特征，但參與這一過程的免疫通路尚未充分闡明。B細胞是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細胞，是免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。然而，B細胞在NASH發(fā)病機制中的作用以及導(dǎo)致它們在肝臟中激活的潛在機制尚不清楚。美國明尼蘇達大學(xué)Xavier Revelo教授等研究團隊在Hepatology（IF 17.425）上發(fā)表了一項題為“Microbiota‐driven activation of intrahepatic B cells aggravates NASH through innate and adaptive signaling”的研究，該研究從單細胞轉(zhuǎn)錄組出發(fā)，并結(jié)合腸道菌群的多樣性，運用多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合，系統(tǒng)闡述腸道微生物群驅(qū)動的B細胞積累和活化會在NASH進展過程中通過先天性和適應(yīng)性免疫機制導(dǎo)致肝臟炎癥和纖維化。

 研究材料

 

 技術(shù)路線

步驟1：HFHC飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠肝臟中存在促炎性B細胞的聚集和活化，而B細胞缺陷小鼠的肝臟炎癥和纖維化得到改善

步驟2：MyD88是B細胞在NASH過程中促進肝臟炎癥、纖維化和損傷所必需的；

步驟3：NASH中的B細胞活化受到B細胞受體信號，提示B細胞活化整合了天然免疫和適應(yīng)性免疫機制;

步驟4：移植NASH患者糞菌增加了受體小鼠肝臟中的B細胞積累和活化，從而加劇NASH，提示腸道菌群因素驅(qū)動了B細胞在NASH中的致病性。

 

 研究結(jié)果

為了確定肝內(nèi)B細胞在NASH進展中的作用，作者用HFHC飲食誘導(dǎo)小鼠NASH，并分離出免疫細胞后識別主要的免疫細胞群，HFHC組的B細胞顯著增加。為了評估B細胞中細胞因子的表達情況，作者發(fā)現(xiàn)分別在丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）和脂多糖（LPS）刺激后，NASH小鼠表達TNF-α和IL-6的B細胞數(shù)量增加。同時，來自NASH小鼠的B細胞也顯示出細胞表面主要組織相容性復(fù)合物 (MHC) I類和II類以及CD86的上調(diào)，這表明活化和抗原呈遞能力增加。以上結(jié)果表明，NASH小鼠中肝內(nèi)B細胞積累，并釋放促炎細胞因子以及呈遞抗原的能力增加。
 

圖1 促炎性B細胞在NASH小鼠的肝臟中積累

 

2. NASH小鼠肝內(nèi)B細胞顯示促炎基因譜

為了更好地了解NASH如何改變B細胞的轉(zhuǎn)錄組譜，作者對來自NCD和HFHC肝臟的免疫細胞進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)24個CD45⁺免疫細胞簇。作者主要關(guān)注了B細胞簇的基因表達譜，發(fā)現(xiàn)炎癥基因Il1b、S100a8等在HFHC肝臟B細胞中表達增加。為了驗證單細胞轉(zhuǎn)錄組對B細胞表達譜的檢測能力，作者還對HFHC和NCD小鼠肝臟B細胞進行了常規(guī)RNA-seq，同樣驗證了幾個促炎基因在HFHC肝臟B細胞中上調(diào)。為了解釋這些數(shù)據(jù)的生物學(xué)意義，作者使用 Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 來檢測基因表達模式，發(fā)現(xiàn)參與炎癥和TLR信號傳導(dǎo)的上游調(diào)節(jié)因子的激活，以及IL10RA和SOCS1的抑制，并且富集到活躍的炎癥途徑。以上結(jié)果顯示NASH小鼠的B細胞活化和炎癥表型增加。
 

圖2 肝內(nèi)B細胞在NASH期間顯示出促炎基因譜

 

3.  B細胞缺陷可改善NASH

為了確定B細胞是否在NASH的發(fā)病機制中起直接作用，作者評估了HFHC喂養(yǎng)的B細胞缺陷μMT小鼠的NASH進展。HFHC μMT小鼠顯示出NAS評分較低，且轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，在HFHC μMT小鼠中，促炎基因的表達顯著降低，B細胞數(shù)目顯著減少，并且HFHC μMT小鼠纖維化明顯減少，纖維化形成基因表達降低，而這些變化在NCD WT和NCD μMT小鼠中并未檢測到，該結(jié)果說明在HFHC喂養(yǎng)后，B細胞可以引起代謝和炎癥紊亂。
 

圖3 B 細胞缺乏可改善NASH期間的炎癥和纖維化

 

4.  促炎基因MyD88介導(dǎo)NASH中B細胞的促炎功能

RNA-seq分析確定MyD88是HFHC小鼠肝B細胞中促炎基因的上游調(diào)節(jié)因子，為了研究B細胞固有的MyD88信號傳導(dǎo)是否影響NASH進展，作者構(gòu)建了B細胞特異性缺失 MyD88 (B-MYD) 的小鼠，HFHC喂養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)B-MYD HFHC小鼠NAS評分較低。雖然B-MYD HFHC和WT HFHC小鼠之間的總數(shù)和亞群免疫細胞群沒有差異，但B-MYD HFHC小鼠的肝內(nèi)B細胞MHC-I和MHC-II減少，這表明TLR介導(dǎo)的激活降低了抗原的呈遞能力。以上結(jié)果表明，B細胞需要MyD88來促進NASH的肝臟炎癥、纖維化和損傷。
 

圖4 MyD88介導(dǎo)NASH中B細胞的炎癥功能

 

5.  BCR刺激激活肝內(nèi)B細胞

BCR與抗原結(jié)合產(chǎn)生的激活信號是B細胞活化的第一信號，接下來作者探究了在NASH過程中肝內(nèi)B細胞的激活是否與BCR信號有關(guān)，因BCR信號傳導(dǎo)在Nur77基因的控制下誘導(dǎo)綠色熒光蛋白 (GFP) 表達，作者給Nur77-GFP小鼠喂食NCD或HFHC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HFHC Nur77-GFP小鼠的GFP+肝內(nèi)B細胞的頻率和數(shù)量顯著增加，表明在NASH期間的激活涉及肝臟中的BCR信號。該結(jié)果表明，NASH中，B細胞的活化受到BCR信號刺激。