5個(gè)單細(xì)胞組織解離Tips

 

實(shí)驗(yàn)秘籍

單細(xì)胞組織解離可能會(huì)由于組織類型、物種、樣品年齡、處理環(huán)境和其他因素的不同，而變得十分困難，需要在實(shí)踐中不斷優(yōu)化以達(dá)到最佳的結(jié)果�？的螤柎髮W(xué)博士候選人Madhav Mantri在一次聚焦免疫學(xué)研究的網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)上分享了他關(guān)于解離小鼠心臟和回腸樣本并用于單細(xì)胞基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，可以總結(jié)為如下5個(gè)Tips：

【1】千錘百“練”

【2】擇善而從

【3】因“材”施策

【4】不妨嘗試連續(xù)酶解

【5】紅細(xì)胞清除要趁早

 

01

千錘百“練”

Mantri的研究聚焦病毒性心肌炎，即由感染引起的心臟炎癥。利用1型呼腸病毒感染的新生小鼠模型，他在感染過程中的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)切除小鼠幼鼠的心臟和腸道回腸組織。

“首先，我必須用模擬老鼠，而不是我將要使用的感染病毒的老鼠做大量的練習(xí)，因?yàn)槲也幌氚阉�有的工作放在通過口服灌胃機(jī)制感染這些新生幼鼠，然后不使用那些組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所以我用相同年齡的模擬幼崽練習(xí)，它們的組織大小幾乎相同。”

除了使用年齡和組織匹配的模型生物樣本外，Mantri還推薦了在使用珍貴的人體樣本時(shí)如何找到可比較的練習(xí)組織。這是生物學(xué)研究中的一個(gè)兩難境地：雖然在使用珍貴的人體樣本之前進(jìn)行練習(xí)是必要的，但由于你所擁有的樣本數(shù)量有限，很難找到真正的人體練習(xí)組織，因?yàn)樗鼈兪�分寶貴。

Mantri建議從文獻(xiàn)入手，確定目標(biāo)組織中的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分，并了解你所將接觸到的捐贈(zèng)者或患者的年齡。他建議使用與年齡相適應(yīng)的小鼠組織進(jìn)行練習(xí)：“找到在哪些年齡的小鼠中你能夠發(fā)現(xiàn)相同的ECM成分，并使用該組織練習(xí)解離。”

ECM構(gòu)成示意圖

此外，人類細(xì)胞圖譜聯(lián)盟提供了一個(gè)對(duì)許多不同的人體組織進(jìn)行編目的數(shù)據(jù)門戶，包括用于單細(xì)胞組織解離的protocol。這是一個(gè)有價(jià)值的工具，可以與審查這些protocol或執(zhí)行這些protocol的科學(xué)家取得聯(lián)系，因?yàn)樗麄兪菃渭?xì)胞實(shí)驗(yàn)中研究這些組織類型的專家。

 

02

擇善而從

Mantri介紹了他的實(shí)驗(yàn)，從組織收集到Ep管，并記錄了樣品處理的最佳做法。首先，因?yàn)樗�使用的是新鮮冷凍單細(xì)胞RNA-seq試劑盒，他很早就計(jì)劃了實(shí)驗(yàn)，并且對(duì)新鮮組織的環(huán)境需求很敏感，以優(yōu)化細(xì)胞活力。針對(duì)心臟組織，他說：

“我會(huì)取出心臟組織，然后把它和冰HBSS溶液一起放在盤子里。然后我會(huì)給心臟灌注確保盡可能多地從心室中抽出血液。然后把組織轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的盤子里，把它切成1毫米見方的小塊。在這期間，組織必須保持在冰冷的溫度，在冰冷洗滌緩沖液中，不應(yīng)該在任何時(shí)候進(jìn)入室溫。”

“我都是在塑料培養(yǎng)皿上完成的，這些培養(yǎng)皿躺在巨大的冰桶上。”

“我把心臟組織放在一個(gè)盤子里洗干凈，然后用鑷子把它取出來，放入新鮮的溶液中。我會(huì)去除大部分HBSS，讓組織半干。我不會(huì)把它浸在很多液體里，而是在盤子的角落放一點(diǎn)HBSS的液體溶液，把我的組織放在那里，然后用刀片在培養(yǎng)皿上切碎。然后我會(huì)用移液管把組織和溶液一起吸進(jìn)去，然后把它轉(zhuǎn)移到一根Ep管上。這就是為什么我不會(huì)（在培養(yǎng)皿中）使用大量溶液的原因，因?yàn)樵陂_始酶解之前，我使用臺(tái)式離心機(jī)清洗切碎的碎片。”

對(duì)于樣本收集和處理來說，練習(xí)也是必不可少的，正如Mantri強(qiáng)調(diào)的那樣，一些組織比其他更難去除，同時(shí)還需保持良好的組織質(zhì)量。例如，動(dòng)物一被處死，腸道回腸組織就開始消化，這就需要迅速將它們放入冰冷的溶液中。在某些情況下，當(dāng)組織更堅(jiān)韌時(shí)，比如心臟，在動(dòng)物體內(nèi)更容易灌注它們。

 

03

因“材”施策

酶解是從切碎的組織中釋放單細(xì)胞的下一個(gè)關(guān)鍵步驟，需要根據(jù)組織和細(xì)胞類型選擇恰當(dāng)?shù)拿负蜁r(shí)間。根據(jù)Mantri的說法，當(dāng)涉及到酶解組織時(shí)，有一個(gè)“最佳點(diǎn)”：“你不能花太長時(shí)間來解離組織，因?yàn)檫@會(huì)影響你的細(xì)胞活力。但加入太多酶也不能太快，因?yàn)槊阜磻?yīng)也會(huì)在對(duì)組織不利的條件下發(fā)生。”

時(shí)間序列實(shí)驗(yàn)可以幫助確定在特定的時(shí)間反應(yīng)中使用適量的酶：

“對(duì)于較低的時(shí)間，你使用較高濃度的酶；于較高的時(shí)間，使用較低濃度的酶。你可以用酶濃度和時(shí)間歷程做一個(gè)表。把組織分成不同的試管，然后進(jìn)行這些反應(yīng)，最后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，找出你的細(xì)胞活力百分比。我一開始是為心臟組織做的，所以我知道我需要至少30分鐘的解離。”

不同酶解離能力

Mantri強(qiáng)調(diào)，尋找解離的最佳點(diǎn)需要特別注意組織的細(xì)胞組成。

“解離是一個(gè)細(xì)胞類型依賴的過程。不同類型的細(xì)胞對(duì)壓力的耐受性不同。例如，心肌細(xì)胞是特定于心臟的細(xì)胞類型，必須非常小心地處理，否則你不會(huì)得到很好的產(chǎn)量……優(yōu)化肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的解離非常重要，因?yàn)樗鼈兯赖煤芸臁?rdquo;

Mantri使用了沃辛頓生化公司提供的數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫為酶解作用提供了心臟組織特異性的建議，他強(qiáng)烈推薦給其他人。此外，Mantri建議，如果你想從樣本中研究一種特定的細(xì)胞類型，比如干細(xì)胞，利用商業(yè)上可用的工具包來解離感興趣的細(xì)胞類型是有效的。

然而，當(dāng)相同的組織對(duì)酶的需求相互沖突時(shí)，解離就會(huì)變得更加復(fù)雜。例如，Mantri發(fā)現(xiàn)回腸組織比最初預(yù)期的要復(fù)雜：腸道由完全不同于絨毛的細(xì)胞類型組成”，這影響了酶反應(yīng)的效率。此外，腸道組織本身對(duì)Mantri在實(shí)驗(yàn)中用于其他組織類型的基本試劑PBS和HBSS的某些成分不耐受。“我們用來破壞（腸道）成纖維細(xì)胞基質(zhì)的解離酶不應(yīng)該含有（胰蛋白酶-EDTA）。但它是用來快速去除腸絨毛的。”在這種情況下，EDTA是一把雙刃劍：它能完美地解離絨毛，但抑制了膠原酶的活性，Mantri想用膠原酶來解離腸壁組織，因?yàn)槟z原酶在溶液中中和了鈣和鎂離子，而鈣和鎂離子是膠原酶發(fā)揮作用所必需的。

Mantri描述了一種解離腸道和絨毛的方法：

“解離壁組織花了一個(gè)多小時(shí)。但當(dāng)我分兩步做時(shí)，把EDTA和絨毛上皮細(xì)胞拿出來，把它們放在冰上，把剩下的壁組織塊轉(zhuǎn)移到一個(gè)新管子里，把它們徹底洗掉，把EDTA去掉。然后加入膠原酶，補(bǔ)充氯化鈣，然后我發(fā)現(xiàn)可以在20分鐘內(nèi)完成。”

這些創(chuàng)新是從不斷試驗(yàn)和失敗中總結(jié)出來的。然而，這些經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)對(duì)他和其他人未來的實(shí)驗(yàn)來說是無價(jià)的。“有時(shí)解離相同的組織可能會(huì)對(duì)試劑有沖突的要求，所以你必須小心，在你開始下一個(gè)反應(yīng)之前，你必須清洗那些以任何方式限制酶反應(yīng)的東西。”

 

04

不妨嘗試連續(xù)酶解

Mantri提供的另一個(gè)既能加速解離過程又能確保最佳細(xì)胞活力的建議是一種稱為“連續(xù)解離”的方法。“進(jìn)行連續(xù)解離是一種非常有效的加速解離的方法，但不是通過增加酶的濃度。”Mantri解釋說，他首先將切碎的組織放入2ml的Ep管中，在熱循環(huán)器上以極低的速度混合。他更詳細(xì)地描述了這個(gè)過程：

“在30分鐘的解離protocol中，每隔10分鐘，我將旋轉(zhuǎn)管下或讓它沉淀，從熱循環(huán)器中取出它，并保持它在壁上穩(wěn)定。我讓大塊的組織沉淀下來，取下懸浮液，把它放在冰上的新管子里。如果有一些細(xì)胞脫離了組織，在溶液中，我不希望它們不高興地停留30或40分鐘。我希望他們?nèi)ヒ粋�(gè)4℃的快樂的地方。所以我會(huì)準(zhǔn)備一個(gè)更大的試管，里面有很多溶液，基本上是很多PBS+BSA，你最終要把細(xì)胞重新掛起來。然后，我會(huì)用新鮮的酶替換酶，以加快整個(gè)流程。如果你使用相同的酶30分鐘，酶的活性在解離過程中是不一樣的。如果每隔10分鐘，換3次酶，就能加速下一輪的解離。解離會(huì)更有效，你已經(jīng)把懸浮狀態(tài)的細(xì)胞取出來，把它們放在PBS BSA溶液中。”

 

05

紅細(xì)胞清除要趁早

在單細(xì)胞懸浮液形成后，在將單細(xì)胞上機(jī)之前，還有幾個(gè)關(guān)鍵的清潔步驟。清洗細(xì)胞懸液是很重要的，以清除不需要的細(xì)胞或碎片，特別是任何殘留的紅細(xì)胞從組織。Mantri分享了他如何確保干凈的細(xì)胞懸液：

“我通常使用紅細(xì)胞裂解緩沖液（ACK裂解緩沖液）來清除紅細(xì)胞。我想說的一件重要的事情是，如果你要做3到4個(gè)洗滌步驟，紅細(xì)胞溶解越快越好。當(dāng)紅細(xì)胞溶解時(shí)，它們會(huì)將RNA釋放到溶液中。如果不是50ml的試管，而是15ml的試管，洗掉任何游離的RNA會(huì)有很大的不同。如果你洗得不夠干凈，溶液中有自由漂浮的RNA，你把它加載到儀器中，這些RNA分子會(huì)在液滴中被編碼，你的數(shù)據(jù)中到處都是背景。”

Mantri強(qiáng)調(diào)，即使在組織分解開始之前，也必須勤奮地進(jìn)行清洗步驟，以確保在這些階段移除盡可能多的不想要的細(xì)胞，就像在紅細(xì)胞分解的這一步一樣。

 

以上就是Mantri關(guān)于單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組織解離經(jīng)驗(yàn)分享的全部內(nèi)容，希望對(duì)同樣開展單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的你有所啟發(fā)和幫助。