研究材料

小鼠心肌細胞（NMCMs），人多能干細胞分化的心肌細胞（hPSC-CMs），心臟組織

 

 技術路線

步驟1：適度心率降低促進心肌細胞增殖；

步驟2：適度心率降低促進心肌損傷后心臟再生；

步驟3：適度心率降低誘導心肌細胞重新進入細胞周期；

步驟4：適度心率降低刺激心肌細胞的代謝模式轉換；

步驟5：轉錄組學分析：適度心率降低促進糖酵解酶的表達，刺激心肌細胞進入細胞周期；

步驟6：代謝組學分析：適度心率降低激活心肌細胞的生物合成代謝。

 

 研究結果

1. 適度心率降低促進心肌細胞增殖

研究人員分別對12周成年小鼠進行抗心律失常藥物和異丙腎上腺素處理4周，發(fā)現(xiàn)所有抗心律失常藥物都能使成年小鼠的心率持續(xù)降低約10%-20%，而異丙腎上腺素則有相反的效果（圖1J）。小鼠心臟組織中，抗心律失常藥物處理增加增殖型心肌細胞比例（圖1L），異丙腎上腺素處理增加總增殖細胞的比例，但未增加增殖型心肌細胞比例（圖1M）。綜上可知，適度心率降低會促進心肌細胞增殖。

圖1 適度心率降低促進心肌細胞增殖

 

2. 適度心率降低促進心臟損傷后心肌再生

為了驗證適度心率降低對心臟修復和再生的影響，研究人員分別對經(jīng)過心尖切除術的新生鼠（圖2A）和心肌梗死的成年小鼠（圖2E）進行抗心律失常藥物處理，發(fā)現(xiàn)處理后心率降低（圖2B和2G），增殖型心肌細胞比例升高（圖2C,2D,2H和2F）�？偟膩碚f，適度心率降低可以促進新生和成年小鼠的心臟再生。

 

圖2 適度心率降低促進心肌損傷后心臟再生

 

3.  適度心率降低誘導心肌細胞重新進入細胞周期

為了深入了解適度心率降低調(diào)節(jié)心肌細胞增殖的機制，對心肌細胞的細胞周期進程進行了分析。流式細胞術結果表明，適度心率降低可降低G1期心肌細胞的比例，增加S期心肌細胞的比例，說明適度心率降低誘導心肌細胞 G1/S期轉變（圖3A）。qPCR和WB結果表明，適度心率降低可上調(diào)心肌細胞中細胞周期蛋白(cyclin D1, E2，A2和B2)和周期蛋白依賴性激酶(CDK1, 2, 4和6) 的表達（圖3B-3D）。細胞周期基因cyclin D-CDK4/6和cyclin E-CDK2的激活對細胞周期進入、G1/S過渡和DNA復制至關重要。提示適度心率降低通過上調(diào)細胞周期基因的表達，從而觸發(fā)心肌細胞重新進入細胞周期。
 

圖3 適度心率降低誘導心肌細胞重新進入細胞周期

 

4.  適度心率降低刺激心肌細胞的代謝模式轉換

能量產(chǎn)生是維持心肌細胞持續(xù)增殖的必要條件，作者進一步探討了適度心率降低后心肌細胞的能量需求變化。發(fā)現(xiàn)適度心率降低后，NMCMs 中AMP/ATP的比值降低（圖4A）。為了進一步揭示適度心率降低作用下心肌細胞的代謝表型，作者用Etomoxir、UK-5099和BPTEs分別抑制長鏈脂肪酸(LCFAs)、葡萄糖和谷氨酰胺的攝入，以此來判斷NMCMs對不同底物進行氧化磷酸化的需求，結果顯示原代心肌細胞仍主要依賴葡萄糖進行氧化磷酸化，而降低心率后其對葡萄糖的氧化依賴進一步增加（圖4B-4F）。綜上：適度心率降低使心肌細胞發(fā)生能量代謝重編程即能量代謝需求降低，而糖酵解是適度心率降低促進心肌細胞增殖的必要步驟。

圖4 適度心率降低刺激心肌細胞的代謝模式轉換

 

5.  轉錄組學分析：適度心率降低促進糖酵解酶的表達，刺激心肌細胞進入細胞周期

為了確定適度心率降低誘導心肌細胞增殖機制，研究人員用抗心律失常藥物處理7日齡小鼠，取心臟組織做轉錄組分析。結果表明，通過藥物適度降低心率后，心肌細胞上調(diào)表達基因普遍與增殖和代謝調(diào)節(jié)有關，包括細胞周期過程、心臟代謝過程和核苷三磷酸代謝過程（圖5C），其中葡萄糖代謝基因表達上調(diào)（圖5D）。WB檢測發(fā)現(xiàn)幾個關鍵糖酵解酶上調(diào)，其中包含PKM2 (圖5E和5F)，它是參與糖酵解的關鍵酶，已被報道可通過核易位激活細胞周期蛋白cyclin D1的轉錄。綜上所述，適度心率降低可以激活糖酵解酶的表達，尤其是PKM2的表達，從而刺激心肌細胞細胞周期再進入。
 

圖5 RNA-seq功能富集結果和幾個關鍵的糖酵解酶WB結果展示

 

6.  代謝組學分析：適度心率降低激活心肌細胞的生物合成代謝

根據(jù)轉錄組學結果，適度心率降低組還富集了多種可能在調(diào)控心肌細胞增殖中發(fā)揮重要作用的代謝途徑。使用[U-¹³C₆]葡萄糖和[U-¹³C₁₆]棕櫚酸酯示蹤劑來研究適度心率降低對心肌細胞代謝通量的影響。發(fā)現(xiàn)，在適度心率降低處理的NMCMs中，葡萄糖的攝入量以及對三羧酸(TCA)中間體和其他單糖的利用均顯著增加(圖6A-6C)。此外，適度心率降低增加了NADPH的產(chǎn)生，降低了NMCMs中NADP+/NADPH的比值(圖6D)。這些結果表明，適度心率降低提高了葡萄糖通過TCA循環(huán)、磷酸戊糖途徑(PPP)和其他生物合成途徑的通量。代謝組學分析進一步證實了這一結果，發(fā)現(xiàn)參與生物合成代謝的代謝物豐度顯著增加(圖6E-6G)，其中差異表達最多代謝物在核苷酸糖生物合成中富集(圖6H)。
 

圖6 [U-¹³C₆]葡萄糖 and [U-¹³C₁₆] 棕櫚酸酯示蹤劑來研究適度心率降低對心肌細胞代謝通量的影響

圖7 非靶代謝展示適度心率降低使得參與核苷酸糖生物合成的代謝物豐度增加

 

 小編小結

心臟損傷后大量心肌細胞丟失和隨后的纖維化導致心力衰竭和突發(fā)心臟病死亡。本研究整合轉錄組，代謝流以及非靶代謝組學技術探討降低心率促進心機損傷后心臟再生修復的分子機制。通過多組學研究發(fā)現(xiàn)，適度心率降低可通過糖代謝酶發(fā)揮非酶活性促進誘導心肌細胞細胞周期重新進入，啟動細胞周期蛋白轉錄，同時還激活代謝功能，為增殖細胞提供能量。本研究發(fā)現(xiàn)適度心率降低是一種體外和體內(nèi)誘導心肌細胞增殖的方法，這為心臟疾病的臨床治療提供了新的思路。