自動(dòng)化PCR-Free解決方案的特點(diǎn)與應(yīng)用優(yōu)勢
常規(guī)高通量測序的文庫構(gòu)建，需要PCR擴(kuò)增。主要是為了對微量DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，提高庫容；另一方面，放大核酸熒光信號(hào)，提高測序準(zhǔn)確度。然而，PCR擴(kuò)增同樣也有著無法忽視一些問題：
什么是PCR-Free技術(shù)
常規(guī)擴(kuò)增建庫有諸多問題，那么PCR-Free技術(shù)也就營運(yùn)而生。PCR-Free技術(shù)，相較于常規(guī)建庫，其建庫步驟為：基因組片段化-末端修復(fù)-加接頭-純化-文庫質(zhì)控，省去了PCR擴(kuò)增的步驟。
llumina DNA PCR-Free Prep，Tagmentation DNA建庫即運(yùn)用了PCR-free的建庫方式，并同時(shí)采用創(chuàng)新型鏈接在磁珠上的轉(zhuǎn)座酶（BLT），將接頭連接和DNA 片段化結(jié)合到一個(gè)簡單快速的反應(yīng)中，實(shí)現(xiàn)WGS高度均勻的覆蓋。
針對PCR-Free建庫方法，我們推出了基于Biomek i7工作站的Illumina DNA PCR free文庫構(gòu)建自動(dòng)化方案，該方案可使用低投入量（25-99ng）或標(biāo)準(zhǔn)投入量（100-2000ng）gDNA進(jìn)行建庫，同時(shí)進(jìn)行96例樣本的建庫。
Biomek i7工作站
圖1. Biomek i7 Hybrid Genomics Workstation工作桌面
圖2. Illumina PCR free DNA Library Prep 自動(dòng)化工作流
使用Biomek i7工作站進(jìn)行 Illumina PCR free文庫構(gòu)建，輕松解放雙手，把更多的活交給工作站來進(jìn)行
表1. Biomek i7 Hybrid Genomics Workstation自動(dòng)化Illumina PCR free流程預(yù)估時(shí)間（大于100ng gDNA投入）
Method Options Selector (MOS）
MOS能夠選擇樣本數(shù)量、投入量、Index開始使用位置，以最大限度地提高靈活性、適應(yīng)性和方法執(zhí)行的簡易性。
圖3. Illumina PCR-Free建庫方法選項(xiàng)選擇器
Guided Labware Setup (GLS)
GLS基于MOS中選擇的選項(xiàng)生成的，并提供用戶特定的圖形設(shè)置說明，包括試劑體積計(jì)算和準(zhǔn)備試劑的分步說明。
圖4. 引導(dǎo)式實(shí)驗(yàn)室設(shè)置提供配方注釋，指示試劑量（上圖），
并指導(dǎo)用戶正確設(shè)置平臺(tái)（下圖）
DeckOptixFinal Check (DFC)
在開始運(yùn)行自動(dòng)化流程之前，BML中的DFC功能，會(huì)通過實(shí)時(shí)拍照的方式分析工作桌面耗材擺放，以減少設(shè)置錯(cuò)誤，例如吸頭、深孔板擺放位置錯(cuò)誤。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
為了證明在i7雙雜交工作站上進(jìn)行96個(gè)樣品文庫制備的能力，我們從人細(xì)胞系NA12878 gDNA制備文庫。將起始濃度為150 ng、300 ng、400 ng、500 ng和750 ng的48個(gè)gDNA樣本以及陰性模板對照（NTC）隨機(jī)放入96孔板，如下所示。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Biomek i7工作站上的Illumina PCR free DNA文庫制備自動(dòng)化是一個(gè)完全獨(dú)立的解決方案，為任何規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室提供了高效、靈活和可擴(kuò)展的解決方案。自動(dòng)化解決方案提供的文庫在下游工作流程中產(chǎn)生高質(zhì)量的結(jié)果，并節(jié)省了寶貴的時(shí)間和金錢。
- 擴(kuò)增過程中產(chǎn)生復(fù)制錯(cuò)誤，累積下去，產(chǎn)生假陽性；
- 擴(kuò)增會(huì)有一定的偏好性，比如GC含量異常的區(qū)域和二級(jí)結(jié)構(gòu)等區(qū)域，擴(kuò)增效率低，難以覆蓋；
- 擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)越多，重復(fù)率（Duplication）越高，造成測序成本增加、浪費(fèi)測序數(shù)據(jù)。
什么是PCR-Free技術(shù)
常規(guī)擴(kuò)增建庫有諸多問題，那么PCR-Free技術(shù)也就營運(yùn)而生。PCR-Free技術(shù)，相較于常規(guī)建庫，其建庫步驟為：基因組片段化-末端修復(fù)-加接頭-純化-文庫質(zhì)控，省去了PCR擴(kuò)增的步驟。
- PCR-Free建庫技術(shù)：
- 省去擴(kuò)增步驟，縮短建庫時(shí)間；
- 避免使用高保真聚合酶，降低建庫成本；
- 減少擴(kuò)增產(chǎn)生的復(fù)制錯(cuò)誤；
- 避免擴(kuò)增偏好性；
- 避免擴(kuò)增產(chǎn)生的Duplication，降低測序成本。
llumina DNA PCR-Free Prep，Tagmentation DNA建庫即運(yùn)用了PCR-free的建庫方式，并同時(shí)采用創(chuàng)新型鏈接在磁珠上的轉(zhuǎn)座酶（BLT），將接頭連接和DNA 片段化結(jié)合到一個(gè)簡單快速的反應(yīng)中，實(shí)現(xiàn)WGS高度均勻的覆蓋。
針對PCR-Free建庫方法，我們推出了基于Biomek i7工作站的Illumina DNA PCR free文庫構(gòu)建自動(dòng)化方案，該方案可使用低投入量（25-99ng）或標(biāo)準(zhǔn)投入量（100-2000ng）gDNA進(jìn)行建庫，同時(shí)進(jìn)行96例樣本的建庫。
- 減少手動(dòng)操作時(shí)間
- 減少系統(tǒng)設(shè)置何潛在的移液錯(cuò)誤
- 標(biāo)準(zhǔn)化工作流程改進(jìn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
- 快速安裝
Biomek i7工作站
圖1. Biomek i7 Hybrid Genomics Workstation工作桌面
- 集成了96通道移液頭與靈活8通道移液頭；
- 靈活8通道可配置固定針和可替換吸頭通道搭配；
- 96通道可選擇上一列、一行、多行等不規(guī)則形狀排列吸頭，實(shí)現(xiàn)不定樣本數(shù)液體轉(zhuǎn)移；
- 斜側(cè)抓板機(jī)械手可360度旋轉(zhuǎn)，輕松實(shí)現(xiàn)臺(tái)面全覆蓋；
- 多達(dá)45個(gè)工作板位；
- 可實(shí)現(xiàn)震蕩、加熱/冷卻、吸頭清洗等功能；
- 開放式工作桌面，可輕松整合外部設(shè)備，如（自動(dòng)PCR儀）。
圖2. Illumina PCR free DNA Library Prep 自動(dòng)化工作流
使用Biomek i7工作站進(jìn)行 Illumina PCR free文庫構(gòu)建，輕松解放雙手，把更多的活交給工作站來進(jìn)行
表1. Biomek i7 Hybrid Genomics Workstation自動(dòng)化Illumina PCR free流程預(yù)估時(shí)間（大于100ng gDNA投入）
Method Options Selector (MOS）
MOS能夠選擇樣本數(shù)量、投入量、Index開始使用位置，以最大限度地提高靈活性、適應(yīng)性和方法執(zhí)行的簡易性。
圖3. Illumina PCR-Free建庫方法選項(xiàng)選擇器
Guided Labware Setup (GLS)
GLS基于MOS中選擇的選項(xiàng)生成的，并提供用戶特定的圖形設(shè)置說明，包括試劑體積計(jì)算和準(zhǔn)備試劑的分步說明。
圖4. 引導(dǎo)式實(shí)驗(yàn)室設(shè)置提供配方注釋，指示試劑量（上圖），
并指導(dǎo)用戶正確設(shè)置平臺(tái)（下圖）
DeckOptixFinal Check (DFC)
在開始運(yùn)行自動(dòng)化流程之前，BML中的DFC功能，會(huì)通過實(shí)時(shí)拍照的方式分析工作桌面耗材擺放，以減少設(shè)置錯(cuò)誤，例如吸頭、深孔板擺放位置錯(cuò)誤。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
為了證明在i7雙雜交工作站上進(jìn)行96個(gè)樣品文庫制備的能力，我們從人細(xì)胞系NA12878 gDNA制備文庫。將起始濃度為150 ng、300 ng、400 ng、500 ng和750 ng的48個(gè)gDNA樣本以及陰性模板對照（NTC）隨機(jī)放入96孔板，如下所示。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
- 隨機(jī)挑取了23個(gè) gDNA文庫進(jìn)行測序，平均插入片段為483bp±28bp
- Reads mapping率為96.8%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%
Biomek i7工作站上的Illumina PCR free DNA文庫制備自動(dòng)化是一個(gè)完全獨(dú)立的解決方案，為任何規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室提供了高效、靈活和可擴(kuò)展的解決方案。自動(dòng)化解決方案提供的文庫在下游工作流程中產(chǎn)生高質(zhì)量的結(jié)果，并節(jié)省了寶貴的時(shí)間和金錢。
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