帕金森。≒arkinson’s disease,PD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病,最主要的病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine, DA)能誘導(dǎo)神經(jīng)元的變性死亡,由此而引起紋狀體DA含量顯著性減少而致病。典型的癥狀就是無(wú)力、遲緩、僵硬…
等等,陳老濕怎么最近也有這種感覺(jué)。。。哦,不對(duì),這是天氣太熱,各地高溫頻頻鬧得。。。
說(shuō)回正題,為了探究PD的確切病因,美國(guó)約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院Dawson實(shí)驗(yàn)室曾命名了一種新的程序性細(xì)胞壞死形式——Parthanatos,又稱(chēng)PARP-1 dependent cell death,是基于DNA損傷,PARP-1激活的細(xì)胞壞死。這種細(xì)胞死亡廣泛地存在于不同的器官不同的疾病中,包括帕金森病、阿爾茨海默癥、多發(fā)性硬化癥、亨廷頓氏舞蹈病等。
圖1
近期,Dawson團(tuán)隊(duì)又有了重磅發(fā)現(xiàn)——抑制PAAN/MIF核酸酶可防止帕金森病的神經(jīng)退行性,相關(guān)《Cell》文章于2022年5月10日在線發(fā)表。該研究揭示了病理性α-突觸蛋白(α-syn)誘導(dǎo)的神經(jīng)變性是通過(guò)Parthanatos相關(guān)凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)核酸酶(PAAN)/巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)的核酸酶活性發(fā)生的。PAAN/MIF的遺傳耗竭和缺乏核酸酶活性的突變體可防止散發(fā)性PD的α-syn預(yù)成纖維(PFF)小鼠模型中多巴胺能神經(jīng)元的缺失和行為缺陷。通過(guò)化合物篩選,研究人員發(fā)現(xiàn)了PAANIB-1—— 一種腦滲透性的PAAN/MIF核酸酶抑制劑,可以防止α-syn PFF、AAV-α-syn過(guò)表達(dá)或MPTP中毒在體內(nèi)誘發(fā)的神經(jīng)退行性。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)可能在人類(lèi)神經(jīng)退行性病癥中具有廣泛的意義。
陳老濕帶大家整理下研究思路:
1 敲除或者耗竭PAAN/MIF核酸酶活性可以減少α-syn PFF引起的病理變化
2 證明PAAN/MIF核酸酶活性誘導(dǎo)的基因組DNA裂解和神經(jīng)元死亡
3 構(gòu)建篩選平臺(tái),通過(guò)受體蛋白復(fù)合物篩選小分子化合物庫(kù)
4 優(yōu)化小分子結(jié)構(gòu),并進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)分析
5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估藥物的特性
首先,研究人員通過(guò)基因敲除(KO)和突變(E22Q、P2G),利用腺相關(guān)病毒(AAV)在MIF KO小鼠中表達(dá)PAAN/MIF WT、PAAN/MIF E22Q和MIF P2G的基因,證實(shí)PAAN/MIF的核酸酶活性,而不是MIF的異構(gòu)酶酶活性,是α-syn PFF誘導(dǎo)的體內(nèi)神經(jīng)退行性病變所必需的(圖 2)。
圖2通過(guò)刪除PAAN/MIF的核酸酶活性,α-Syn PFF誘導(dǎo)的病理學(xué)特征減少
接著,研究人員確定了PAAN/MIF核酸酶轉(zhuǎn)位介導(dǎo)了α-syn PFF誘導(dǎo)的基因組DNA裂解和神經(jīng)元死亡。AIF和PAAN/MIF在α-syn PFF給藥后相互作用,它們?cè)诩?xì)胞核內(nèi)共同定位(圖3C)。PAAN/MIF WT、E22Q和MIF P2G在對(duì)α-syn PFF的反應(yīng)中的核轉(zhuǎn)位沒(méi)有差異。敲除PAAN/MIF可以防止α-syn PFF誘導(dǎo)的基因組DNA裂解(圖3D)、細(xì)胞死亡(圖3E和3F)。在MIF KO神經(jīng)元中,通過(guò)慢病毒表達(dá)PAAN/MIF WT和MIF P2G可恢復(fù)基因組DNA的裂解和細(xì)胞死亡,但在用PAAN/MIF E22Q和AIF結(jié)合缺陷突變體PAAN/MIF E22A的神經(jīng)元中未觀察到DNA裂解和細(xì)胞死亡(圖3D-3F)。在PAAN/MIF E22Q和MIF P2G回補(bǔ)的神經(jīng)元中也得到了類(lèi)似的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明,PAAN/MIF的核酸酶活性及其與AIF的結(jié)合對(duì)基因組DNA的裂解和α-syn PFF誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是必需的。
圖3PAAN/MIF核酸酶活性是預(yù)防α-syn PFF誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的關(guān)鍵
在確認(rèn)了PAAN/MIF核酸酶活性是誘導(dǎo)α-syn PFF引發(fā)病理性變化的關(guān)鍵證據(jù)后,研究人員構(gòu)建了一個(gè)基于熒光顯色的DNA完整性篩選平臺(tái)(圖4A)。當(dāng)MIF具有核酸酶活性就可以結(jié)合到基因組DNA上,從而破壞DNA雙鏈完整性,導(dǎo)致熒光信號(hào)降低或消失。當(dāng)抑制劑與MIF結(jié)合后,MIF不再具備核酸酶活性,因此熒光信號(hào)正常顯示。通過(guò)這一平臺(tái)的構(gòu)建,研究人員篩選了具有45,000個(gè)候選分子的化合物庫(kù)。經(jīng)過(guò)多輪篩選,最終找到了編號(hào)C8的化合物能防止用人α-syn PFF處理的人皮質(zhì)神經(jīng)元的基因組DNA裂解(圖4G和4H),并且可以在口服后仍具有穿過(guò)血腦屏障(Blood Brain Barrier)的能力。
圖4PAAN/MIF核酸酶抑制劑的篩選與鑒定
為了優(yōu)化C8的效力并增加其中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的滲透性,研究人員設(shè)計(jì)了一個(gè)C8衍生物,優(yōu)化后命名為C8-31(以下稱(chēng)為parthanatos-associated nuclease inhibitor-1,PAANIB-1),它與C8的不同之處在于增加了一個(gè)氟(圖5B)。PAANIB-1能有效地抑制PAAN/MIF核酸酶的活性和Parthanatic細(xì)胞的死亡(圖5A)。PAANIB-1抑制MNNG誘導(dǎo)的Parthanatic細(xì)胞死亡的IC50為0.28 μM,C8的IC50為0.52 μM(圖5C)。PAANIB-1與C8相似,通過(guò)抑制PAAN/MIF核酸酶的活性,保護(hù)神經(jīng)元免受α-syn PFF引起的突觸障礙、NAD+減少和細(xì)胞死亡。
圖5PAANIB-1是一種PAAN/MIF核酸酶抑制劑
然后,研究人員需要確定PAANIB-1如何影響PAAN/MIF核酸酶,首先就要判斷PAANIB-1與PAAN/MIF是否直接結(jié)合?
PAAN/MIF與PAANIB-1的結(jié)合實(shí)驗(yàn)不出意外地選用了Octet® BLI(生物層干涉)分子互作分析系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測(cè),結(jié)果表明二者的親和力KD值為1.56 μM(圖6A)。
研究人員構(gòu)建PAAN/MIF三聚體模型,預(yù)測(cè)了PAAN/MIF的61-64、67-68、73、98-100和106位的氨基酸是潛在的PAANIB-1結(jié)合點(diǎn)。對(duì)推定結(jié)合位點(diǎn)周?chē)拿總(gè)殘基進(jìn)行了丙氨酸突變。其中,在PAAN/MIF L62A、PAAN/MIF 61-64A和PAAN/MIF N73A突變體中,PAANIB-1對(duì)MNNG誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的保護(hù)作用明顯減弱(圖6C)。進(jìn)一步測(cè)定PAAN/MIF WT和丙氨酸突變體與PAANIB-1的結(jié)合動(dòng)力學(xué),結(jié)果表明,PAAN/MIF WT和Y100A突變體與PAANIB-1結(jié)合,而L62A和N73A突變體的結(jié)合明顯減弱(圖6D)。
圖6PAANIB-1與PAAN/MIF的抑制作用機(jī)制是直接相互作用
文章最后,作者將PAANIB-1作為口服藥物,通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)的行為能力測(cè)試評(píng)估及病理實(shí)驗(yàn)證實(shí)PAANIB-1是一個(gè)具有成藥潛力的小分子核酸酶抑制劑。這在開(kāi)發(fā)靶向可藥物化的PAAN/MIF核酸酶的細(xì)胞死亡抑制劑方面提供了啟示和指導(dǎo)作用。
Summary
縱觀整篇文章,作者結(jié)合目前常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法和手段,完成了出色的研究工作。其中體外的互作驗(yàn)證,采用BLI方法進(jìn)行的蛋白與小分子結(jié)合動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。基于BLI的Octet®是檢測(cè)結(jié)合動(dòng)力學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)之一,已經(jīng)被寫(xiě)入美國(guó)藥典?焖贉(zhǔn)確,結(jié)實(shí)耐用,成本低~
Octet® 分子互作分析系統(tǒng)
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-參考文獻(xiàn)-
Park et al., PAAN/MIF nuclease inhibition prevents neurodegeneration in Parkinson’s disease, Cell (2022).https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.04.020