自1956年研究人員首次在細胞培養(yǎng)中發(fā)現支原體污染以來，支原體污染問題無處不在。[1]支原體污染非常不易察覺。有的實驗室被支原體污染后，如果不進行有效徹底的支原體檢測并清除，該實驗的細胞培養(yǎng)很難進行下去，細胞傳代3代以后狀態(tài)就急劇下滑，無法進行正常實驗，甚至需要更換細胞間。綜合FDA、美國模式菌種收集中心（ATCC）等機構收到的相關數據，世界各國細胞系支原體污染的平均比例為30-60%。[2]一項來自賓夕法尼亞大學的研究顯示，在NCBI的2012-2013年的GEO項目中，約11％含有支原體污染[3]，支原體污染已經成為細胞培養(yǎng)工作中最顯著的問題之一。
 

 

支原體污染是個循序的過程，因其沒有細胞壁，普通抗生素對其無效[4]。根據已發(fā)表的支原體污染研究文獻，支原體污染細胞后，幾乎能影響每一個細胞參數。其可能導致細胞染色體的異常和損傷，改變細胞的代謝、生長、形狀、附著，甚至會影響到基因表達。此外，支原體污染能耗盡營養(yǎng)物，促進代謝積累，重度支原體污染還將導致培養(yǎng)基pH改變。

 

為了全面了解支原體污染情況，來自加州大學的John Hogenesch教授獲得了九千多份樣本的RNA測序數據，這些樣本來自于2012年-2013年間哺乳動物細胞的基因表達研究[3]。John在測序數據中尋找支原體DNA，結果發(fā)現11%的樣本都受到了支原體的污染。

 

據John表示，支原體DNA水平最高的一些研究，曾發(fā)表在Cell、Nature和PNAS等頂尖雜志上。雖然支原體污染并不一定意味著這些研究結果無效，但這種微生物會影響數百個基因的表達，并與細胞競爭營養(yǎng)阻礙細胞的生長。在其中一組淋巴瘤細胞受污染的數據中，John鑒定出了61個被支原體改變的基因。由此可見，支原體感染能在不知不覺中干擾研究結果，浪費大量的科研資金和寶貴的時間——John的實驗室曾遇到過一次支原體污染，雖然問題很快得到解決，但仍然浪費了大約十萬美元和一年的研究。

 

在細胞培養(yǎng)的各個環(huán)節(jié)，都容易受到支原體污染，比如操作人員的疏忽、培養(yǎng)基更換時操作不規(guī)范、細胞在實驗室間流通時缺乏質控等，由于細胞受到支原體污染時形態(tài)不易發(fā)生變化，因此很難通過簡單觀察辨別細胞是否收到了污染，等到發(fā)現細胞感染了支原體時，已經為時已晚。

 

支原體檢測方法對比
 

最近十年里，有兩種經典的方法被用于常規(guī)支原體檢測，它們的靈敏度和可靠性已經獲得了證實：培養(yǎng)法和指示細胞培養(yǎng)法。在過去幾年里，支原體檢測對速度快、靈敏度高且穩(wěn)健性高的需求日益增加。

 

在分子檢測技術出現之前，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法一直是微生物檢測的金標準，迄今為止，全球范圍內仍將它作為支原體常規(guī)檢測方案。不同于培養(yǎng)法，指示細胞培養(yǎng)方法通過對培養(yǎng)物的DNA染色來判斷是否存在支原體生長�？捎糜谀承�“挑剔”的支原體檢測，因為這些支原體不能在用于培養(yǎng)方法的標準培養(yǎng)基中生長。

 

除了以上兩種藥典認證的方法外，目前實驗室常用的方法還有DNA熒光染色法、PCR擴增技術、環(huán)介導的等溫擴增法等。通常需要一種操作簡單，耗時較短，靈敏度較高，結構準確的方法以應對日常檢測的需求，其中PCR擴增技術、環(huán)介導的等溫擴增法以耗時短見長，而DNA熒光染色法和生長抑制試驗因操作簡單受到青睞，以下是各種方法的優(yōu)勢對比。
 

幾種檢測方法對比，部分數據來源參考文獻5

 

一般來說，新的細胞株都需要做支原體檢測，細胞培養(yǎng)期間，建議每1-2周進行一次支原體檢測以防止污染。以上列舉的檢測支原體方法各有優(yōu)勢，但是即便通常被認為是“金標準”的培養(yǎng)法，也可能會漏掉某些需要特殊培養(yǎng)條件的“精挑細選”的支原體。因此，在實驗室的日常研究需求中，需要一種快速、全面的檢測方法以應對日常的檢測需求。

 

Lonza MycoAlertTM

簡便易行的支原體快檢

Lonza MycoAlert™支原體檢測試劑盒主要有兩大優(yōu)勢：1）操作簡單；2）檢測時間短。

 

其通過檢測在支原體和其柔膜細菌中存在的乙酸激酶和氨基甲酸激酶的活性，完成支原體檢測。僅需兩步簡單操作，20分鐘即可完成檢測。這兩種酶在導致95%支原體污染的6個種屬和大多數的柔膜細菌中均存在，但在真核細胞中不存在，此法既可保證檢測的準確性，又可快速完成檢測。
 

檢測原理

檢測流程和結果判定

 

此外，該試劑盒的檢測范圍包括所有常規(guī)的支原體和甾原體，適用于實驗室細胞培養(yǎng)環(huán)境的檢測與篩選。其對設備要求低的特性適合搭配大部分可以檢測luminescence模式的多功能酶標儀，且可搭配lucetta 2光度計進行MycoAlert檢測的特定模式和基于luciferase的相關試驗檢測。此外，lucetta 2光度計無需PC，體積小便于移動，可適用于實驗室間移動檢測。
 

Lonza MycoAlert™支原體檢測試劑盒除細胞培養(yǎng)上清外，還可以檢測血清，未使用過的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基補充物等。此外其操作簡單、檢測迅速、通用性高、特異性強的特點，已幫助很多實驗室建立了細胞株監(jiān)測體系以預防支原體污染，值得一提的是，Lonza MycoZap™支原體去除試劑，通過抗生素與抗代謝試劑聯用可有效去除支原體，確保研究可靠。

 

小結

支原體污染是生物制品外源因子污染檢查的經典話題，生物源性原材料、采用細胞培養(yǎng)技術制備的疫苗、抗體、基因治療產品在研發(fā)過程的不同階段都需要進行支原體檢測。此外，幾乎涉及到細胞培養(yǎng)的研究也都需要防范支原體的污染，目前尚無一勞永逸地預防手段，這就要求在研發(fā)過程的各個環(huán)節(jié)中需要嚴格遵循操作規(guī)范，且由于支原體的隱蔽性較強，增加檢測次數是性價比較高的預防手段。

 

來源：醫(yī)麥客

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