隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用的快速發(fā)展，離子淌度這一概念的引入，蛋白質(zhì)組學(xué)已步入4D新時(shí)代，引領(lǐng)臨床蛋白質(zhì)組學(xué)在鑒定準(zhǔn)度、鑒定深度、定量準(zhǔn)確性、檢測(cè)周期等性能上全面提升，并在基礎(chǔ)研究、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)、臨床蛋白質(zhì)組學(xué)等各個(gè)方面展現(xiàn)出了廣闊的發(fā)展前景和強(qiáng)大的生命力。值得一提的是，在新冠病毒疫情全球大流行之際，4D蛋白質(zhì)組學(xué)下的大隊(duì)列新冠患者樣本臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究也為抗擊病毒做出了貢獻(xiàn)。

4D蛋白質(zhì)組學(xué)究竟是如何輕松解決大隊(duì)列、復(fù)雜體系以及微量樣本檢測(cè)的？而高通量蛋白質(zhì)組學(xué)又是如何通過(guò)大規(guī)模樣本集推進(jìn)臨床研究的？帶著這些疑問(wèn)，一起來(lái)看看臨床蛋白質(zhì)組學(xué)專家是如何利用4D蛋白質(zhì)組學(xué)推進(jìn)臨床研究的。

 

“我們的研究所與醫(yī)院緊密相連，有許多合作，其中蛋白質(zhì)組學(xué)已成為主要研究戰(zhàn)略的一部分。這意味著臨床研究人員對(duì)其樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的需求越來(lái)越大。與此同時(shí)，每次臨床研究的平均樣本數(shù)也大幅上升。而這正是高通量蛋白質(zhì)組學(xué)大顯身手的地方。”

--牛津大學(xué)標(biāo)靶研究所臨床蛋白質(zhì)組學(xué)Roman Fischer教授

 

1

臨床蛋白質(zhì)組學(xué)面臨的挑戰(zhàn)

過(guò)去，蛋白質(zhì)組學(xué)并不是臨床研究的驅(qū)動(dòng)力，因?yàn)闃颖炯�通常非常小。此外，由于�?dāng)時(shí)質(zhì)譜儀的速度、靈敏度和分辨率有限，很難實(shí)現(xiàn)完整蛋白質(zhì)組的覆蓋。臨床樣本通常具有挑戰(zhàn)性，蛋白質(zhì)含量極高，動(dòng)態(tài)范圍高[1]。這給質(zhì)譜分析帶來(lái)了復(fù)雜性，因?yàn)橘|(zhì)譜儀的動(dòng)態(tài)范圍通常比臨床樣本中蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)范圍小得多[2]。

而基于Bruker timsTOF Pro的4D蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)，改變了這種情況，提高了分析時(shí)間和穩(wěn)健性，使高通量蛋白質(zhì)組學(xué)成為可能。

基于timsTOF Pro的4D蛋白質(zhì)組學(xué)使研究人員能夠重復(fù)測(cè)量所有檢測(cè)到的離子的碰撞截面（CCS）值，這些值可用于進(jìn)一步提高系統(tǒng)的選擇性，從而從復(fù)雜樣本和短梯度分析中獲得越來(lái)越可靠的相對(duì)定量信息[3]。

有研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，基于timsTOF Pro的4D蛋白質(zhì)組學(xué)除了能夠進(jìn)行離子遷移信息的常規(guī)測(cè)量，還在保留時(shí)間、質(zhì)荷比（m/z）、離子遷移率 (1/K0) 和MS1強(qiáng)度方面實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的4D特征校準(zhǔn)（圖1）。校準(zhǔn)提高了定量血漿蛋白的數(shù)量，在一次11.5分鐘的LC-MS/MS運(yùn)行中超過(guò)500個(gè)蛋白質(zhì)，如果將所有運(yùn)行結(jié)合起來(lái)，共定量772個(gè)蛋白質(zhì)（圖2）[4]。達(dá)到這種深度提供了全新的可能性，分析大樣本隊(duì)列的數(shù)百至數(shù)千個(gè)樣本，以發(fā)現(xiàn)血漿中的生物標(biāo)志物。

圖1 通過(guò)MS/MS鑒定和4D特征比對(duì)定量蛋白質(zhì)的數(shù)量。A 在混合樣品（QC）和樣品中通過(guò)MS/MS定量的蛋白質(zhì)。B 如果MS/MS鑒定在保留時(shí)間、m/z、離子遷移率 (1/K0) 和強(qiáng)度上進(jìn)行4D特征比對(duì)，則每個(gè)樣品的定量蛋白數(shù)。C LC-MS/MS測(cè)量的時(shí)間過(guò)程，有和沒(méi)有4D特征對(duì)齊。 圖2 從血漿樣本中選擇的蛋白質(zhì)覆蓋了近五個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍。分析深度足以量化經(jīng)典血漿蛋白（例如CRP）、組織滲漏蛋白（例如PSA）和細(xì)胞因子（例如IFN-γ）�；�于timsTOF Pro的4D蛋白質(zhì)組學(xué)兼具高通量和靈敏度，是在大樣本隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記物的有力工具。

PASEF技術(shù)可以在不損失靈敏度或分辨率的情況下實(shí)現(xiàn)>100 Hz的序列速度。這是通過(guò)使四極隔離質(zhì)量窗口與TIMS通道中特定肽包的洗脫時(shí)間同步來(lái)實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)多次選擇，可以提高低豐度肽的MS/MS光譜質(zhì)量。從少于200 ng的樣品負(fù)載中可以獲得更好的結(jié)果，因此減少了樣品制備成本和MS維護(hù)頻率。使用90分鐘的梯度長(zhǎng)度，可以從典型的人類細(xì)胞系裂解液中識(shí)別出5400多個(gè)蛋白質(zhì)組。

穩(wěn)健性是基于timsTOF Pro的4D蛋白質(zhì)組學(xué)研究的另一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)。關(guān)于這種能力對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的影響，F(xiàn)ischer教授是這樣說(shuō)的：“通常情況下，一個(gè)儀器需要在200個(gè)血樣后進(jìn)行清潔。在高通量環(huán)境下，這意味著高頻率的儀器清潔，嚴(yán)重影響研究進(jìn)度。而我們?cè)趖imsTOF Pro儀器上運(yùn)行的最大樣本批次是4500次非衰竭血液注射，這是極具挑戰(zhàn)性的樣本之一。

基于timsTOF Pro的4D蛋白質(zhì)組學(xué)還可以從少量高度復(fù)雜的混合物中提供可重復(fù)的定量信息。Fischer教授解釋道：“達(dá)到100+Hz，這意味著它有可能每秒識(shí)別100個(gè)或更多的肽。與其他儀器相比，我們可以真正縮短梯度時(shí)間，即使是對(duì)于總細(xì)胞裂解物之類的樣本，也不會(huì)影響我們獲得的數(shù)據(jù)深度。此外，該儀器也非常敏感。可以說(shuō)，是在不會(huì)影響靈敏度的前提下提高了速度和穩(wěn)健性。”

 

2

對(duì)高通量蛋白質(zhì)組學(xué)的需求不斷增長(zhǎng)

自從越來(lái)越多的人將蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用到課題研究中以來(lái)，需求大幅上升，這是對(duì)其他組學(xué)的補(bǔ)充。

Fischer教授和他的團(tuán)隊(duì)使用蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)確定腫瘤在空間環(huán)境中的功能。他說(shuō)道：“因?yàn)楝F(xiàn)在我們可以將蛋白質(zhì)組學(xué)與其他技術(shù)相結(jié)合，如激光捕獲顯微切割（LMD），這是一種非常有趣的方法，因?yàn)樗�允許我們維持蛋白質(zhì)組的空間背景。目前，我們?nèi)栽谂�力了解大型結(jié)構(gòu)（如腫瘤或器官）中的空間分辨分子相互作用。我們?cè)谀[瘤血管周圍看到炎癥標(biāo)記物，但在其他地方看不到，因此我們?cè)噲D了解這些腫瘤在分子水平上發(fā)生了什么。這將影響靶向蛋白質(zhì)以及如何將藥物輸送到最有效的位置。通過(guò)結(jié)合MS和LMD，我們可以重新定義表型。基本上，蛋白質(zhì)組成為細(xì)胞表型的一部分，因?yàn)樗�現(xiàn)在可以通過(guò)空間分辨率觀察到。我喜歡稱之為‘表型蛋白質(zhì)組’。顯然，這種方法也可以以空間對(duì)應(yīng)的方式與基因組或其他組學(xué)分析相結(jié)合。”

 

3

新冠肺炎患者的分類

當(dāng)前，基于timsTOF Pro的4D蛋白質(zhì)組學(xué)最值得一提的應(yīng)用，就是實(shí)現(xiàn)新冠肺炎感染中宿主免疫反應(yīng)的深層表型[5]。

這項(xiàng)研究涉及200-300名患者，其中一些患者在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集樣本，并在Bruker-timsTOF Pro上使用高通量蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析。該研究采用了一種新的方法，使用這些樣本的亞組與其他組學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析，例如某些血細(xì)胞的位點(diǎn)分析。血漿蛋白質(zhì)組能夠?qū)�亞表型分型到患者群中，這可以預(yù)測(cè)嚴(yán)重程度和結(jié)果（圖3和4）[5]。在對(duì)同一組樣本進(jìn)行的這項(xiàng)大型研究中使用的8種組學(xué)中，蛋白質(zhì)組學(xué)最適合將新冠肺炎患者分為不同的疾病嚴(yán)重程度組，而其他技術(shù)則提供了數(shù)據(jù)來(lái)幫助理解潛在的生物學(xué)意義。

圖3 高通量蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)新冠肺炎疾病嚴(yán)重程度組進(jìn)行主成分分析 圖4 定量蛋白質(zhì)的無(wú)監(jiān)督分層聚類揭示了與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)的血漿蛋白質(zhì)群

該蛋白質(zhì)組分析確定了特定的血漿急性期蛋白水平作為嚴(yán)重疾病的指標(biāo)，并有證據(jù)表明急性期炎癥、補(bǔ)體激活/攻擊、纖維蛋白凝塊、蛋白酶、血清淀粉樣蛋白、組織壞死、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)。發(fā)現(xiàn)了血漿蛋白特征，可用于將急性住院新冠肺炎病例分層為疾病亞表型，聚類成員可為反應(yīng)狀態(tài)提供信息，并與差異28天死亡率相關(guān)。

這一多組學(xué)血液圖譜等研究將為新冠肺炎未來(lái)的藥物開(kāi)發(fā)、臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)和個(gè)性化藥物治療方法提供必要的見(jiàn)解。

 

參考文獻(xiàn)：

[1]Cox J and Mann M (2011), Quantitative, High-Resolution Proteomics for Data-Driven Systems Biology, Annu. Rev. Biochem. 80: 273-299.

[2]Keshishian H, Burgess MW, Specht H, Wallace L, Clauser KR, Gillette MA, & Carr SA. (2017), Quantitative, multiplexed workflow for deep analysis of human blood plasma and biomarker discovery by mass spectrometry. Nature protocols, 12(8), 1683-1701.

[3]Meier F, Brunner AD, Koch S, Koch H, Lubeck M, Krause M, Goedecke N, Decker J, Kosinski T, Park M, Bache N, Hoerning O, Cox J, Räther O, Mann M. (2018), Online parallel accumulation – serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer, Mol. Cell. Proteomics, https://doi.org/10.1074/mcp. TIR118.000900.

[4]Kosinski T, Heilig R, Bensaddek D, Bache N, Bjeld Hørning O, Fischer R, Koch H., Plasma proteomics goes high throughput – timsTOF Pro with PASEF and 4D feature alignment to quantify 500 plasma proteins in 11.5 min. Bruker Daltonics 03-2019, LCMS-151, 1867805.

[5]Covid-19 Multi-omics Blood ATlas (COMBAT) Consortium (2022), Cell 185, 916–938, 2022. Published by Elsevier Inc. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.01.012 ll