靶向GPC3的CAR-T細(xì)胞對(duì)有細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)風(fēng)險(xiǎn)的肝細(xì)胞癌患者的治療初顯成效。幾種采用天然TCR信號(hào)傳導(dǎo)的T細(xì)胞過繼療法(ACT)在實(shí)體腫瘤中誘導(dǎo)了更有效的抗腫瘤功能,并減少了相對(duì)于CAR的細(xì)胞因子產(chǎn)生。
該研究構(gòu)建的sFv-ε T細(xì)胞在減少細(xì)胞因子釋放的同時(shí)顯示出良好的抗腫瘤效果。RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)這可能與鈣-鈣調(diào)磷酸酶-NFAT信號(hào)通路活性較低有關(guān)。此外,研究進(jìn)一步構(gòu)建GPC3特異性7sFv-ε T細(xì)胞,并在臨床前小鼠模型中評(píng)估了其抗腫瘤活性,揭示了GPC3特異性7sFv-ε T細(xì)胞在實(shí)體腫瘤治療中的潛力。
文章詳情
發(fā)表時(shí)間:2022-04-19
發(fā)表期刊:Molecular Therapy – Oncolytics(IF=7.2)
關(guān)鍵詞:GPC3;嵌合sFv-CD3ε受體;IL-7;免疫療法;實(shí)體腫瘤;RNA-seq
研究對(duì)象:小鼠
研究方法:RNA-seq、流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化等
DOI:10.1016/j.omto.2022.04.003.
研究背景
靶向GPC3的CAR-T細(xì)胞對(duì)有細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)風(fēng)險(xiǎn)的肝細(xì)胞癌患者的治療初顯成效。幾種采用天然TCR信號(hào)傳導(dǎo)的T細(xì)胞過繼療法(ACT)在實(shí)體腫瘤中誘導(dǎo)了更有效的抗腫瘤功能,并減少了相對(duì)于CAR的細(xì)胞因子產(chǎn)生。為了提高靶向GPC3的ACT的有效性和安全性,研究用與CD3ε連接的抗GPC3單鏈可變區(qū)片段(sFv)修飾T細(xì)胞,將其整合到整個(gè)TCR/CD3復(fù)合物中,形成嵌合sFv-CD3ε受體(sFv-ε)。發(fā)現(xiàn)sFv-ε T細(xì)胞在減少細(xì)胞因子產(chǎn)生的同時(shí)顯示出良好的抗腫瘤活性,RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)這可能與鈣-鈣調(diào)磷酸酶-NFAT信號(hào)通路活性較低有關(guān)。研究進(jìn)一步構(gòu)建了IL-7共表達(dá)的小鼠sFv-ε T細(xì)胞(7sFv-ε),發(fā)現(xiàn)在具有免疫功能的小鼠模型中,與傳統(tǒng)的sFv-ε T細(xì)胞相比,7sFv-ε T細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的持久性、抗腫瘤療效和免疫記憶性,同時(shí),保留了與CRS相關(guān)的低細(xì)胞因子的產(chǎn)生。這些結(jié)果表明,GPC3特異性7sFv-ε T細(xì)胞可能是一種潛在實(shí)體腫瘤治療策略。
研究思路
研究結(jié)果
1. 與CAR-T細(xì)胞相比,人sFv-ε T細(xì)胞具有自激活減輕的TCR樣信號(hào)傳導(dǎo)
為了探究sFv-ε是否可以介導(dǎo)TCR樣信號(hào),用原代人T細(xì)胞制備的抗GPC3 sFv-ε T或CAR-T細(xì)胞。未轉(zhuǎn)導(dǎo)(UTD)T細(xì)胞做為對(duì)照,評(píng)估被GPC3肽激活時(shí)sFv-ε T或CAR-T細(xì)胞中關(guān)鍵TCR信號(hào)分子的磷酸化動(dòng)力學(xué)和持續(xù)時(shí)間。接下來,研究者進(jìn)一步分析了抗原非依賴性信號(hào)傳導(dǎo)(tonic signaling)是否會(huì)促進(jìn)T細(xì)胞分化和衰竭。結(jié)果表明,在抗原刺激下,sFv-ε可以誘導(dǎo)內(nèi)源性CD3ζ的磷酸化,暗示sFv-ε可以通過整個(gè)TCR/CD3復(fù)合體轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原激活。此外,與CARs相比,sFv-ε顯著減弱了抗原非依賴性信號(hào)(圖1)。
圖1 在人28ζ CAR、BBζ CAR和sFv-ε T細(xì)胞中激活、分化和抑制表型的不同特征
2、人sFv-ε T細(xì)胞在減少細(xì)胞因子產(chǎn)生的同時(shí)顯示出良好的抗腫瘤效果
與CAR-T細(xì)胞治療相關(guān)的CRS的特點(diǎn)是外周細(xì)胞因子升高,包括IL6、IFNγ、TNFα、IL2和GM-CSF。通過體外細(xì)胞因子釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),sFv-ε T細(xì)胞通常比CAR-T細(xì)胞誘導(dǎo)的IL6、IFNγ、TNFα、IL2和GM-CSF的分泌更少(圖2B)。評(píng)估sFv-ε和CAR-T細(xì)胞在PLC/PRF/5荷瘤小鼠體內(nèi)的抗腫瘤療效(圖2C)發(fā)現(xiàn),在注射T細(xì)胞7天后與28ζ和BBζ CAR-T組相比,sFv-ε T組外周血中CD4+和CD8+T細(xì)胞的持久性增強(qiáng)(圖2D)。sFv-ε T細(xì)胞在早期誘導(dǎo)腫瘤消退的程度優(yōu)于CAR-T細(xì)胞(圖2E)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),sFv-ε T細(xì)胞或BBζ CAR-T細(xì)胞比28ζ CAR-T細(xì)胞更有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)(圖2F)。在另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中,研究人員檢測(cè)了接受了大量T細(xì)胞的荷瘤小鼠體內(nèi)的細(xì)胞因子。與CAR-T細(xì)胞治療的小鼠相比,sFv-ε T細(xì)胞治療的小鼠外周血和腫瘤組織中存在人IFNγ、TNFα、IL2和小鼠IL6減少的趨勢(shì)(圖2G)。這些數(shù)據(jù)表明,人GPC3特異性sFv-ε T細(xì)胞在減少一些與CRS相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生的同時(shí)顯示出與CAR-T細(xì)胞相比具有競(jìng)爭(zhēng)力的抗腫瘤效果。
圖2 人28ζ CAR、BBζ CAR和sFv-ε T細(xì)胞的抗腫瘤活性和細(xì)胞因子產(chǎn)生的特征
3、與CAR相比,sFv-ε介導(dǎo)的鈣-鈣調(diào)磷酸酶-NFAT信號(hào)活性較低
為探究sFv-ε或CAR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)是否不同,對(duì)受高水平GPC3肽刺激的T細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq。如圖3C所示,與28ζ或BBζ CAR-T細(xì)胞相比,sFv-ε T細(xì)胞中許多NFAT調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平降低,包括IFNγ、TNFα、IL2和GM-CSF。鈣/鈣調(diào)磷酸酶/NFAT網(wǎng)絡(luò)在細(xì)胞因子的產(chǎn)生中起著重要作用。細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加導(dǎo)致鈣調(diào)磷酸酶的快速激活,導(dǎo)致NFAT去磷酸化、核易位和隨之而來的基因轉(zhuǎn)錄。此外,鈣調(diào)磷酸酶抑制劑FK506幾乎完全消除了所有工程T細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ、TNFα和IL2,表明這些細(xì)胞因子主要受鈣調(diào)磷酸酶-NFAT通路調(diào)控(圖3B);蚣患治觯℅SEA)顯示,鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)在sFv-ε T細(xì)胞中的正調(diào)控活性低于CAR-T細(xì)胞(圖3D)。因此,研究進(jìn)一步分析了人sFv-ε細(xì)胞和CAR-T細(xì)胞與PLC/PRF/5細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平。sFv-ε T細(xì)胞中Ca2+的增加幅度和持續(xù)時(shí)間均低于CAR-T細(xì)胞(圖3E)。這些發(fā)現(xiàn)表明,sFv-ε T細(xì)胞中鈣-鈣調(diào)磷酸酶-NFAT通路的活性低于CAR-T細(xì)胞,這可能有助于減少IFNγ、TNFα和IL2的產(chǎn)生。
圖3 sFv-ε或CAR介導(dǎo)的鈣-鈣調(diào)磷酸酶-NFAT信號(hào)通路的特征
4、IL7共表達(dá)可提高小鼠7sFv-ε T細(xì)胞的體外存活率
為了提高T細(xì)胞的存活率和免疫記憶,通過將sFv-ε和IL7與一個(gè)2A肽序列融合,構(gòu)建了小鼠sFv-ε,共表達(dá)IL7(圖4A)。用各自的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)C57BL/6小鼠的脾T細(xì)胞,生成sFv-ε、7sFv-ε或CAR T細(xì)胞。分析小鼠T細(xì)胞的記憶分化和衰竭表型發(fā)現(xiàn)sFv-ε和7sFv-εT細(xì)胞的CD44+CD62L+中樞記憶性T細(xì)胞比例高于28ζ和BBζ CAR T細(xì)胞(圖4C和圖4D),與CAR T細(xì)胞相比,sFv-ε和7sFv-εT細(xì)胞的PD-1和LAG-3表達(dá)顯著降低(圖4E和圖4F)。為了評(píng)估T細(xì)胞對(duì)IL2缺乏誘導(dǎo)凋亡的易感性,在沒有加入IL2的情況下,T細(xì)胞孵育24小時(shí)。與預(yù)期相符,7sFv-εT細(xì)胞的凋亡率顯著低于其他工程T細(xì)胞(圖4G和圖4H)。利用Western blot分析細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果表明,與其他工程T細(xì)胞相比,7sFv-ε T細(xì)胞降低了caspase 3的活化,同時(shí)上調(diào)表達(dá)了抗凋亡的Mcl-1、Bcl-xL和Survivin(圖4I)。此外,在低濃度IL2的體外培養(yǎng)條件下,7sFv-ε T細(xì)胞比傳統(tǒng)的sFv-ε T細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力。
圖4 IL7對(duì)小鼠7sFv-ε T細(xì)胞的體外作用
5、7sFv-εT細(xì)胞顯示出良好的體內(nèi)抗腫瘤效果
小鼠工程T細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤活性首次在Hepa 1-6-GPC3模型中評(píng)估,該模型具有免疫應(yīng)答特性(圖5C)。傳統(tǒng)的sfv-ε和28Z CAR T細(xì)胞抑制腫瘤生長(zhǎng)和延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間,而BBζ CAR T細(xì)胞在6只小鼠中的3只里更早失去抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力。與其他工程T細(xì)胞相比,7sFv-εT細(xì)胞在治療40天后在6只小鼠中的4只里完全根除了腫瘤,并顯著提高了小鼠的存活率(圖5D和圖5E)。而進(jìn)一步用原位E0771-GPC3模型評(píng)估發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的SFV-εT細(xì)胞和CAR T細(xì)胞無法控制腫瘤的進(jìn)展,然而7sFv-εT細(xì)胞仍表現(xiàn)出比其他細(xì)胞更快的抗腫瘤作用,并最終幾乎完全消除腫瘤(圖5G和圖5H)。在Hepa 1-6-GPC3模型中檢測(cè)細(xì)胞因子的釋放,發(fā)現(xiàn)在外周血中,sFv-ε和7sFv-εT細(xì)胞比BBζ CAR T細(xì)胞產(chǎn)生或誘導(dǎo)更低水平的IFNγ、TNFα 和 IL6。而在腫瘤組織里,與CAR T細(xì)胞相比,上述兩種細(xì)胞具有產(chǎn)生更少IFNγ和TNFα的趨勢(shì)(圖5I)。結(jié)果表明,sFv-ε和7sFv-ε T細(xì)胞與CAR-T細(xì)胞相比,可能降低免疫活性宿主的CRS風(fēng)險(xiǎn)。
圖5 小鼠28ζ CAR、BBζ CAR、sFv-ε和7sFv-ε T細(xì)胞的抗腫瘤活性和細(xì)胞因子產(chǎn)生的特性
6.IL7的共表達(dá)提高了小鼠7sFv-εT細(xì)胞的持久性,并在體內(nèi)誘導(dǎo)了免疫記憶
為了闡明7sFv-ε T細(xì)胞抗腫瘤能力增強(qiáng)的機(jī)制,研究了T細(xì)胞在Hepa 1-6-GPC3模型中的持久性。如圖6A和6B所示,7sFv-ε和28ζ CAR-T組比sFv-ε和BBζ CAR-T組有更多的CD4+ T細(xì)胞。7sFv-ε T細(xì)胞增加了CD8+ T細(xì)胞和9F2+ T細(xì)胞的積累,其次是sFv-ε,28ζ CAR-T和BBζ CAR-T細(xì)胞。7sFv-ε T細(xì)胞組的轉(zhuǎn)導(dǎo)基因拷貝數(shù)顯著高于其他T細(xì)胞工程組(圖6C)。此外,7sFv-ε T細(xì)胞組的腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+細(xì)胞顆粒酶B表達(dá)升高,表明其抗腫瘤的細(xì)胞溶解能力增強(qiáng)(圖6D)。7sFv-ε T細(xì)胞處理的小鼠脾臟中9F2+ T細(xì)胞存活率最高(圖6E)。鑒于這些發(fā)現(xiàn),7sFv-ε T細(xì)胞抗腫瘤能力的提高應(yīng)該至少部分歸因于輸入的T細(xì)胞的持久性增加。在用7sFv-ε T細(xì)胞去除原發(fā)腫瘤后,在小鼠的兩側(cè)脅腹重新注射Hepa 1-6-GPC3細(xì)胞(圖6J)。7sFv-ε T細(xì)胞處理組小鼠與對(duì)照組比較表明,在持續(xù)4周以上的全部6只小鼠中,腫瘤均立即消除,這表明7sFv-ε T細(xì)胞治療可以提供長(zhǎng)期保護(hù),防止腫瘤復(fù)發(fā)(圖6K)。
圖6 7sFv-ε T細(xì)胞治療提高了T細(xì)胞的持久性和免疫記憶
研究結(jié)論
sFv-ε可以顯著降低相對(duì)于CARs的T細(xì)胞自激活,并介導(dǎo)抗原特異性TCR樣信號(hào)。與28ζ和BBζ CAR-T細(xì)胞相比,人類和小鼠的傳統(tǒng)sFv-ε T細(xì)胞在減少細(xì)胞因子產(chǎn)生的同時(shí)表現(xiàn)出相同或更強(qiáng)的抗腫瘤療效。GPC3特異性7sFv-ε T細(xì)胞進(jìn)一步提高了抗腫瘤免疫功能,同時(shí)保留了CRS相關(guān)細(xì)胞因子的低產(chǎn)量,提示它可能是一種有效、安全的實(shí)體腫瘤治療策略。參考文獻(xiàn):
Yansha Sun, Yiwei Dong, Ruixin Sun, Yifan Liu, Yi Wang, Hong Luo, Bizhi Shi, Hua Jiang, Zonghai Li,Chimeric anti-GPC3 sFv-CD3ε receptor-modified T cells with IL7 co-expression for the treatment of solid tumors,Molecular Therapy - Oncolytics,Volume 25,2022,Pages 160-173,ISSN 2372-7705,https://doi.org/10.1016/j.omto.2022.04.003.