非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD) 是一種常見的健康問題，其患病率在全球范圍內迅速增加。眾所周知，包括遺傳和環(huán)境因素在內的多種因素會導致 NAFLD 的發(fā)展。信號素是細胞外信號蛋白，信號素 7A (SEMA7A)是一種糖基磷脂酰肌醇錨定膜蛋白；初步研究表征了SEMA7A 突變的小鼠的肝細胞出現(xiàn)水腫和脂肪變性，推測 SEMA7A 突變可能導致脂質代謝紊亂和 NAFLD 發(fā)展。
 

2022年8月，陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院（又名西南醫(yī)院）柴進課題組在JCI insight （IF 9.484）上發(fā)表題為“SEMA7A^R148W mutation promotes lipid accumulation and NAFLD progression via increased localization on the hepatocyte surface”的研究文章。本項目利用蛋白質組學和靶向代謝組學技術研究了Sema7a^R145W 突變（相當于人類 SEMA7A^R148W）造成小鼠肝臟的脂質沉積的分子機制，表明SEMA7A^R148W 突變是 NAFLD 的重要的遺傳決定因素，并通過增強蛋白激酶 C（PKC-α）信號傳導引起小鼠肝內脂滴積聚。針對肝臟 中PKC-α 信號的靶向抑制，有望成為新的 NAFLD 療法。中科新生命為其提供了TMT蛋白組學，脂質組學，靶向代謝組（中長鏈脂肪酸）檢測的技術服務。

 研究材料

NAFLD患者活檢肝臟樣本；野生型（WT），Sema7a^R145W雜合子和純合子小鼠肝臟

 

 技術路線

步驟1：肝臟活檢分析SEMA7A 雜合子突變與NAFLD嚴重程度相關；

步驟2：通過Sema7a^R145W突變小鼠，進一步研究 SEMA7A 突變在 NAFLD中的作用；

步驟3：中長鏈脂肪酸檢測發(fā)現(xiàn)純合突變小鼠肝臟中FA和TG增加；

步驟4：蛋白質組學、qPCR和WB發(fā)現(xiàn)Sema7a^R145W調控脂質合成關鍵基因與激酶；

步驟5：qPCR 和蛋白質印跡分析表明Sema7a^R145W突變增加其在膜上表達，并激活肝細胞中的PKC-α信號傳導。

 

 研究結果

1. SEMA7A 雜合突變與NAFLD嚴重程度顯著相關

為了探究SEMA7A 突變是否是NAFLD的潛在危險因素，研究人員分析了470 名 NAFLD患者，找出17名具有SEMA7A雜合突變的肝臟樣本及13名配對的對照肝臟樣本。肝臟組織學分析顯示，具有 SEMA7A 雜合突變的 NAFLD 患者的脂肪變性和 NAS 的嚴重程度顯著高于其匹配的對照組。

圖1 伴或不伴 SEMA7A 雜合突變的配對 NAFLD 患者的基線特征

 

2. Sema7a^R145W雜合突變小鼠的NAFLD嚴重程度和肝功能水平顯著升高

為了進一步研究SEMA7A 突變在 NAFLD 進展中的功能作用，構建了Sema7a^R145W（相當于人類 SEMA7A^R148W）雜合子小鼠。在用高脂飲食 (HFD) 喂養(yǎng) 26 周后，我們發(fā)現(xiàn)雜合子小鼠的體重，肝臟重量和肝臟/體重比均顯著高于對照組。組織學評估顯示Sema7a^R145W雜合子小鼠中的肝脂滴和NASs也顯著增加。與對照組相比，肝臟TG，總膽固醇（Tch）以及血清ALT和AST的水平顯著增加。因此，Sema7a^R145W雜合子突變促進了小鼠NAFLD的進展。
 

圖2 Sema7a^R145W雜合子突變促進HFD喂養(yǎng)后小鼠NAFLD的進展

 

3.  Sema7a^R145W突變可增強小鼠肝臟中的FA和TG合成以及FA攝取

收集10 周齡的雄性 WT 和 Sema7a^R145W 純合子小鼠（每組 n = 4）的肝臟樣本，通過中長鏈脂肪酸的靶向代謝組學和定量脂質組學分析表明，與對照組相比，Sema7a^R145W純合突變顯著增加了小鼠肝臟 FA 和 TG聚積。

 

圖3 靶向代謝組和脂質組學數(shù)據(jù)分析
 

接下來，標記定量蛋白質組學分析顯示，在 5874 個定量蛋白質中，232 個蛋白被上調，260 個蛋白被下調。通過實時定量PCR (qPCR) 和蛋白質印跡分析表明，Sema7a^R145W純合突變上調了FA 和 TG 合成的關鍵基因（Acaca/Acc1、Fasn、Scd1、Gpat 和 Lipin2）、FA攝取基因（Cd36、Fatp5 和 Caveolin1）和 FA 分解代謝基因（Plin3、Plin5 和 Cpt1β）。這些數(shù)據(jù)表明 Sema7a^R145W突變增強了小鼠肝臟 FA 和 TG 合成以及 FA 攝取。

圖4 蛋白質組學鑒定結果、火山圖和KEGG通路注釋

圖5 Sema7a^R145W突變增加了小鼠肝臟中的FA和TG合成以及FA攝取

 

4. Sema7a^R145W突變通過增強 PKC-α 信號傳導，促進轉錄因子 Srebp1 和 Chrebp 以及核受體 Lxr 的表達，增強肝臟 FA 和 TG 合成和 FA 攝取

研究人員調研發(fā)現(xiàn)PKC-α 信號傳導介導糖尿病大鼠的脂質代謝。通過蛋白表達分析，發(fā)現(xiàn)核受體Srebp1、Chrebp、Lxr及其靶基因 Acc1、Fasn、Scd1、Cd36 的表達和PKC-α 磷酸化水平，在 Sema7a^R145W純合子的肝臟和原代肝細胞中顯著增加。這些發(fā)現(xiàn)表明，Sema7a^R145W突變通過增加小鼠肝細胞中 PKC-α磷酸化，增強核 Srebp1、Chrebp 和 Lxr 表達，從而促進FA 和 TG 合成和 FA 攝取。
 

圖6 關鍵因子的蛋白表達的相對水平的蛋白質印跡分析

 

5. Sema7a^R145W突變增加其在細胞膜上表達，并激活肝細胞中的PKC-α信號傳導

免疫熒光和免疫組織化學表明 Sema7a^R145W純合突變顯著增加了肝細胞膜上的Sema7a蛋白。對小鼠原代肝細胞的膜蛋白進行檢測顯示，Sema7a^R145W 純合突變增加了膜上Sema7a 與其受體集成素 β1 蛋白結合，但與另一種 Sema7a 受體 plexin C1無關。通過抑制集成素 β1的表達，可顯著降低 Sema7a^R145W純合小鼠原代肝細胞中 PKC-α 磷酸化水平以及 Sema7a 和 PKC-α 之間的相互作用，表明 Sema7a^R145W突變通過其受體集成素 β1激活PKC-α信號通路。

圖7 免疫熒光、免疫組化、免疫共沉淀分析結果

 

 小結

綜上所述，本文揭示了SEMA7A^R148W突變導致脂質在肝細胞中積累的潛在機制。首先，SEMA7A^R148W突變增加膜上的Sema7a蛋白，并與其受體集成素β1蛋白結合，增強肝細胞中的PKC-α磷酸化水平。其次，激活的PKC-α信號可增強轉錄因子SREBP1和ChREBP以及核受體LXR的表達，促進肝細胞中的FA和TG合成以及FA攝取，引起肝臟中脂滴的積累，導致NAFLD的發(fā)展。