顯微鏡應用：DISC-Δ3可變剪切抑制興奮性突觸生長導致精神分裂癥
陸軍軍醫(yī)大學的博士生庾光丹與
中山大學附屬第七醫(yī)院助理研究員蘇一洵
精神分裂癥（Schizophrenia）是一種復雜的神經(jīng)精神疾病，癥狀包括幻覺，妄想與難以清晰思考等，在全球300人中即可確診一例[1]。DISC1（Disrupted-in-schizophrenia-1, DISC1）是較為明確的精神分裂癥風險基因之一[2, 3]。
研究發(fā)現(xiàn)DISC1的部分致病單核苷酸突變將導致DISC1的可變剪切增加，其中DISC1-Δ3（缺少外顯子3的剪切體）在精神分裂癥病人中顯著升高[4]，但其致病機制仍不清楚。功能上，DISC1除了可調(diào)控神經(jīng)元功能，也在膠質(zhì)細胞中發(fā)揮重要作用，如DISC1可調(diào)控少突膠質(zhì)前體細胞的分化[5]。RNA測序數(shù)據(jù)顯示，DISC1在人與小鼠的少突膠質(zhì)前體細胞中高度表達[6, 7]。
長期以來，少突膠質(zhì)前體細胞（OPC）僅被認為是作為少突膠質(zhì)細胞的前體，進行髓鞘再生，課題組近期研究也發(fā)現(xiàn)了OPC在神經(jīng)精神疾病中獨立于髓鞘之外的新作用[8]。然而，OPC中DISC1可變剪切的作用以及在精神分裂癥中是否參與了疾病的發(fā)生發(fā)展，仍需進一步研究。
2022年9月21日，陸軍軍醫(yī)大學牛建欽教授團隊在Molecular Psychiatry上發(fā)表了題為Pathological oligodendrocyte precursor cells revealed in human schizophrenic brains and trigger schizophrenia-like behaviors and synaptic defects in genetic animal model的研究論文。
該論文利用精神分裂癥病人組織樣本，發(fā)現(xiàn)精神分裂癥病人的不同腦區(qū)中OPC都呈現(xiàn)出異常的復雜形態(tài)，并且這種OPC的異常形態(tài)在作者構(gòu)建的在OPC中增強DISC1-Δ3表達的小鼠中得以復現(xiàn)。
作者進一步證實，這種DISC1-Δ3增強表達的異常OPC，而非少突膠質(zhì)細胞或髓鞘化異常，驅(qū)動了精神分裂癥發(fā)生。OPC中DISC1-Δ3的表達促使了細胞內(nèi)Wnt/β-catenin通路的過度激活，導致下游Wif1的表達增強。Wif1作為Wnt配體的拮抗蛋白，抑制神經(jīng)元的非經(jīng)典Wnt通路，導致了興奮性突觸形成減少，神經(jīng)元興奮性突出后電位幅度降低。
在OPC特異表達DISC1-Δ3的模型小鼠中敲低或敲除OPC中Wif1的表達，可挽回小鼠的突觸生長抑制以及小鼠的精神分裂癥癥狀。論文揭示了OPC中DISC1-Δ3表達在精神分裂癥中的致病機制，提出Wif1為潛在的藥物靶點。
論文作者圍繞精神分裂癥中OPC的作用進行了探索，并首先關(guān)注了精神分裂癥病人中OPC的組織學變化。在病人的海馬、皮層、以及杏仁核樣本中通過OPC標記物NG2染色發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥病人中OPC的數(shù)量沒有發(fā)生變化，然而OPC的展現(xiàn)出更為復雜的形態(tài)（圖2）。
圖2 精神分裂癥病人中少突膠質(zhì)前體細胞的異常復雜形態(tài)
為模擬病人腦中的病理改變，作者構(gòu)建了DISC1-exon3-flox小鼠，與NG2-CreERT小鼠交配得到NG2-CreERT:DISC1-exon3-flox/+小鼠（以下簡稱DISC1-Δ3小鼠），可在OPC中特異增強DISC1-Δ3的表達。在出生第25天（P25）的免疫組化檢測顯示，DISC1-Δ3小鼠展現(xiàn)出與病人同樣的OPC形態(tài)復雜化，同時也伴隨髓鞘形成減少。
有趣的是，DISC1-Δ3小鼠同樣展現(xiàn)出精神分裂癥癥狀，以及病人中類似的興奮性突觸減少[9, 10]（圖3）。作者進一步設(shè)計實驗，證明DISC1-Δ3小鼠中的突觸形成缺陷與神經(jīng)精神癥狀是OPC本身的異常導致，而非髓鞘形成缺陷介導。
圖4 DISC1-Δ3 OPC中Wnt/β-catenin異常激活
作者進一步分析RNA測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，DISC1-Δ3 OPC中一系列分泌蛋白的表達升高，尤其Wnt/β-catenin信號通路下游的Wif1，并通過免疫熒光等一系列實驗驗證。同樣的，精神分裂癥病人樣本中Wif1免疫染色的信號也顯著提高。Wif1可通過與Wnt配體結(jié)合，阻止它們與受體的互作，從而抑制細胞的Wnt下游通路激活。作者分離了DISC1-Δ3小鼠中海馬神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)其中非經(jīng)典Wnt信號通路受到了抑制。
體外實驗發(fā)現(xiàn)，Wif1處理的確可以抑制神經(jīng)元的非經(jīng)典Wnt通路，伴隨突觸形成減少。作者進一步特異敲低或敲除了DISC1-Δ3小鼠OPC中WIF1，發(fā)現(xiàn)可挽救DISC1-Δ3小鼠中海馬的興奮性突觸形成以及精神分裂癥相關(guān)行為缺陷（圖5）。
圖5 OPC來源的Wif1介導DISC1-Δ3小鼠的興奮性突觸缺陷與精神分裂癥相關(guān)行為產(chǎn)生
綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)了DISC1-Δ3可變剪切體在OPC中的增強表達模擬了病人中的異常OPC形態(tài)，并足以導致突觸形成缺陷與精神分裂癥癥狀。DISC1-Δ3導致OPC中Wnt/β-catenin的過度激活與下游Wif1過表達，從而通過抑制神經(jīng)元中非經(jīng)典Wnt通路，抑制突觸形成。這些研究發(fā)現(xiàn)為精神分裂癥的治療提供了新的理論基礎(chǔ)與新靶點。
文章中精神分裂組和對照組的海馬區(qū)域神經(jīng)突觸的電流記錄，使用了Olympus BX51WI結(jié)合電生理設(shè)備進行了可視化記錄，并使用Olympus激光掃描共聚焦顯微鏡FV3000采集神經(jīng)元突觸。這套Olympus FV3000配置了60X 超高分辨率OHR系列專用物鏡，其數(shù)值孔徑高達1.5，OHR系列物鏡是在獲得高數(shù)值孔徑高分辨率的同時，兼顧了高平場性和復消色差校正，確保量化數(shù)據(jù)更為直觀準確。
左下：Olympus 研究級全玻片掃描系統(tǒng) VS200
右上：Olympus 專業(yè)物鏡
右下：Olympus BX51WI
陸軍軍醫(yī)大學的博士生庾光丹與中山大學附屬第七醫(yī)院助理研究員蘇一洵為本文共同第一作者，曼切斯特大學Alexei Verkhratsky教授、陸軍軍醫(yī)大學肖嵐教授與牛建欽教授（Lead Contact）為本文共同通訊作者。
2. Sachs, N.A., et al., A frameshift mutation in Disrupted in Schizophrenia 1 in an American family with schizophrenia and schizoaffective disorder. Mol Psychiatry, 2005. 10(8): p. 758-64.
3. Hennah, W., et al., DISC1 association, heterogeneity and interplay in schizophrenia and bipolar disorder. Mol Psychiatry, 2009. 14(9): p. 865-73.
4. Ma, L., et al., Cloning and characterization of Disc1, the mouse ortholog of DISC1 (Disrupted-in-Schizophrenia 1). Genomics, 2002. 80(6): p. 662-72.
5. Vasistha, N.A., et al., Familial t(1;11) translocation is associated with disruption of white matter structural integrity and oligodendrocyte-myelin dysfunction. Mol Psychiatry, 2019. 24(11): p. 1641-1654.
6. Lake, B.B., et al., Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain. Nat Biotechnol, 2018. 36(1): p. 70-80.
7. Zhang, Y., et al., An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.J Neurosci, 2014. 34(36): p. 11929-47.
8. Wang, Y., et al.,Reduced Oligodendrocyte Precursor Cell Impairs Astrocytic Development in Early Life Stress. Adv Sci (Weinh), 2021.8(16): p. e2101181.
9. Gao, R. and P. Penzes, Common mechanisms of excitatory and inhibitory imbalance in schizophrenia and autism spectrum disorders. Curr Mol Med, 2015. 15(2): p. 146-67.
10. Canitano, R. and M. Pallagrosi, Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Front Psychiatry, 2017. 8: p. 69.
