文獻解讀：儲軍課題組開發(fā)出的新型高性能基因編碼的cAMP熒光探針
深圳先進院儲軍研究員為該論文的通訊作者，深圳先進院助理研究員王亮博士及北京大學鄔春靈博士為該論文的共同第一作者。該工作得到了北京大學李毓龍課題組、中國科學院神經(jīng)科學研究所徐敏課題組和何杰課題組、中山大學附屬第五醫(yī)院陳守登課題組、美國堪薩斯州立大學Ho Leung Ng課題組、中國科學院深圳先進技術研究院路中華課題組和鄭煒課題組及華中科技大學高尚邦課題組等多個合作伙伴的大力支持。
為了開發(fā)適用于活體檢測的高靈敏度探針，研究人員將環(huán)化重排綠色熒光蛋白(cpGFP)插入細菌MlotiK1通道的cAMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域(mlCNBD)中。經(jīng)過插入位點篩選、連接肽優(yōu)化、熒光蛋白及感應模塊優(yōu)化，得到了具有高亮度、高靈敏度、合適親和力和快響應速度等特征的高性能基因編碼cAMP綠色熒光探針G-Flamp1。非常有意思的是，晶體結(jié)構(gòu)顯示G-Flamp1探針的連接肽具有獨一/無二的結(jié)構(gòu)：其中一個連接肽是一個非常剛性的 β-strand 結(jié)構(gòu)，這在其它晶體結(jié)構(gòu)已知的環(huán)化重排熒光蛋白探針中是不存在的，為開發(fā)其它高性能探針提供了新思路和新方法。
在體外實驗中，結(jié)合/未結(jié)合cAMP的G-Flamp1有不同發(fā)色團環(huán)境。G-Flamp1在450nm(單光子)或者900-920nm(雙光子)激發(fā)下，動態(tài)范圍達最大，即ΔF/F0約為13。G-Flamp1與cAMP親和力適中，其解離常數(shù)Kd值為2.17µM。G-Flamp1可在亞秒時間分辨率上檢測cAMP動態(tài)變化。在培養(yǎng)細胞中，該探針均勻分布在細胞質(zhì)和細胞核中，本底熒光亮度介于同類探針cAMPr和Flamindo2之間。G-Flamp1探針在活細胞中的動態(tài)范圍達到了12倍，是目前少數(shù)幾個動態(tài)范圍在10倍以上的熒光蛋白探針之一。同時該探針具有良好的特異性和可逆性(圖1)。
圖1 G-Flamp1探針在體外和培養(yǎng)細胞內(nèi)的表征
隨后，研究人員將G-Flamp1探針應用于果蠅這一模式生物中。果蠅腦部蘑菇體(mushroom body)的Kenyon細胞中cAMP信號通路在氣味相關的記憶中發(fā)揮關鍵作用。作者首先獲取了Kenyon細胞中表達G-Flamp1探針的轉(zhuǎn)基因果蠅，然后利用雙光子進行成像，果蠅受到氣味或電擊刺激時，蘑菇體不同子區(qū)域呈現(xiàn)不一樣的cAMP信號時空變化(圖2)，暗示不同子區(qū)域可能在聯(lián)想性學習中起著相對獨立的作用。
圖2 不同刺激下果蠅Kenyon細胞中cAMP信號的變化
為驗證G-Flamp1探針在活體動物中檢測cAMP動態(tài)變化的實用性，研究人員利用腺相關病毒在小鼠運動皮層中共表達綠色G-Flamp1探針和紅色jRGECO1a鈣探針�；铙w雙光子成像揭示了跑步運動中細胞特異性的cAMP信號，其與鈣信號無明顯相關性(圖3)。這反映了小鼠運動時大腦皮層M1神經(jīng)元反應的異質(zhì)性。
圖3 運動過程中小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)cAMP信號的變化
最后，研究人員在小鼠大腦深部的伏隔核（NAc）腦區(qū)中表達G-Flamp1探針，并利用光纖記錄聽覺巴甫洛夫條件反射任務中該腦區(qū)cAMP信號的變化。結(jié)果表明，隨著訓練的熟練，小鼠得到獎賞時cAMP信號幅度在降低，而聽到相應聲頻信號時cAMP信號幅度在升高(圖4)；該特性與多巴胺信號類似，暗示多巴胺釋放引起了cAMP信號。綜上，G-Flamp1探針的高信噪比和高時間分辨率能夠高靈敏檢測到活體小鼠中內(nèi)源性cAMP信號的動態(tài)變化。
圖4 巴甫洛夫條件反射任務中小鼠NAc腦區(qū)cAMP信號的變化
在未來研究中，研究人員將進一步提高探針性能，開發(fā)適用于不同應用場景的下一代高靈敏cAMP探針，并利用其揭示活細胞和活體中cAMP信號的規(guī)律、調(diào)控機制及生物學功能。與此同時，結(jié)合高內(nèi)涵藥物篩選平臺，上述探針也將嘗試應用于針對GPCR受體的藥物篩選，以期發(fā)現(xiàn)更多的具有臨床價值的GPCR藥物。
儲軍，研究員，博士生導師。中國科學院百人計劃A類。廣東省生物醫(yī)學光學影像技術重點實驗室副主任。2001年獲華中科技大學生物技術專業(yè)學士學位；2004年獲華中科技大學生物醫(yī)學工程專業(yè)碩士學位；2009年獲得華中科技大學生物醫(yī)學工程專業(yè)博士學位，2009-2015年分別在麻省大學阿莫斯特分校和斯坦福大學進行博士后研究。2015年加入中科院深圳先進技術研究院。研究方向為新型光學和光聲分子探針的開發(fā)、分子信號通路的光學成像和光遺傳學、分子診斷和藥物篩選等研究等。目前已主持2項國家自然科學基金面上項目、主持和參與2項國家重點研發(fā)計劃，并主持多項深圳市項目，在Nature Biotechnology、Nature Methods、Nature Communications、PNAS等國際知名雜志發(fā)表論文30余篇。申請15項發(fā)明專利，并授權7項。
課題組長期招收博士后、博/碩士生和研究助理，歡迎大家聯(lián)系，儲軍老師郵箱：jun.chu@siat.ac.cn。
