肌腱病是一種進(jìn)行性肌肉骨骼疾病，其特征是肌腱的炎癥和退行性變化，導(dǎo)致疼痛、腫脹和功能受損，然而目前仍缺乏有效的治療方法。在肌腱病和其他疾病的起始和進(jìn)展過程中，各種亞型的免疫細(xì)胞在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。而在這些免疫細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞能夠浸潤受損的肌腱，調(diào)節(jié)局部炎癥及愈合過程。巨噬細(xì)胞的表型包括M1和M2表型，其中M1巨噬細(xì)胞浸潤至損傷部位，釋放各種不利于組織修復(fù)的促炎細(xì)胞因子，而M2巨噬細(xì)胞能夠參與后期的愈合過程，具有清除細(xì)胞內(nèi)病原體和促進(jìn)肌腱再生的能力�；�于此，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性可能是治療肌腱病變的一種有效治療途徑。
 

iMSC-lEVs在活體肌腱病變模型中的治療機(jī)制及巨噬細(xì)胞復(fù)極調(diào)節(jié)機(jī)制示意圖

 圖1 iMSC-sEVs and iMSC-lEVs的分離與表征圖
 

圖2 iMSC-lEVs治療可改善疼痛相關(guān)行為并調(diào)節(jié)體內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤

圖3 iMSC-lEVs治療降低大鼠體內(nèi)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)
 

為了進(jìn)一步研究iMSC-lEVs對(duì)巨噬細(xì)胞復(fù)極的調(diào)節(jié)作用，研究人員采用RAW 264.7作為研究對(duì)象。在驗(yàn)證lEVs和sEVs可以被RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)化后，用100 ng/ml LPS刺激RAW 264.7細(xì)胞6 h，從而誘導(dǎo)為M1型巨噬細(xì)胞，然后分別用sEVs或lEVs處理48 h，而未受LPS刺激和處理的細(xì)胞被認(rèn)為是M0型巨噬細(xì)胞。通過RT-qPCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lEVs處理降低了促炎基因的表達(dá)，并增加抗炎基因的表達(dá)。進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)分析表明，在lEVs治療后，M1巨噬細(xì)胞的百分比下降，而M2巨噬細(xì)胞的百分比增加。此外，10⁸粒/mL的lEVs與10⁹粒/mL的sEVs具有相似的功能。這些結(jié)果表明iMSC-lEVs能夠調(diào)節(jié)M1巨噬細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變，并抑制炎癥（圖4）。  
5.iMSC-lEVs通過調(diào)節(jié)p38 MAPK信號(hào)通路部分調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化
為了研究iMSC-lEVs調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化轉(zhuǎn)變的機(jī)制，研究人員使用RNA-seq分析iMSC-lEVs處理后RAW 264.7細(xì)胞的基因表達(dá)。采用GSEA與IPA分析挖掘數(shù)據(jù)結(jié)果，顯示許多差異表達(dá)基因與炎癥過程高度相關(guān)，主要包括p38 MAPK信號(hào)通路等。為了驗(yàn)證iMSC-lEVs可能通過調(diào)節(jié)p38 MAPK信號(hào)通路使巨噬細(xì)胞從M1極化至M2，研究人員通過Western blot檢測不同條件下巨噬細(xì)胞中p38的磷酸化水平。結(jié)果顯示，LPS刺激后p38的磷酸化水平上調(diào)，而lEVs處理后p38的磷酸化水平降低，說明lEVs可以抑制p38 MAPK通路的激活。之后研究者在iMSC-lEVs中加入p38 MAPK激動(dòng)劑并與LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞共孵育48h，結(jié)果表明加入p38 MAPK激動(dòng)劑后，M1巨噬細(xì)胞的百分比增加，M2巨噬細(xì)胞的百分比降低，說明lEVs的復(fù)極化調(diào)節(jié)功能部分被p38 MAPK信號(hào)通路的激活所阻斷。綜上結(jié)果，表明iMSC-lEVs調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞復(fù)極化至少部分是通過抑制p38 MAPK信號(hào)通路。
   
6、iMSC-lEVs調(diào)節(jié)人肌腱組織中巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性和浸潤性炎癥細(xì)胞因子
進(jìn)一步的，研究者探究iMSC-lEVs在肌腱病患者中的效果。選取肌腱病患者的肌腱組織，并與iMSC-lEVs體外培養(yǎng)。結(jié)果顯示，iMSC-lEVs顯著降低M1巨噬細(xì)胞的比例，并增加M2巨噬細(xì)胞的比例。此外，iMSC-lEVs能夠降低炎性細(xì)胞因子IL-1β、tnf - α、IL-6和NGF的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)與之前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，從而進(jìn)一步證實(shí)iMSC-lEVs對(duì)人體肌腱組織的有效性。
 
小結(jié)：
文章作者證明iMSC-lEVs能夠部分通過DUSP2和DUSP3介導(dǎo)p38 MAPK信號(hào)通路，使炎性巨噬細(xì)胞向抗炎巨噬細(xì)胞進(jìn)行極化轉(zhuǎn)變，從而減輕肌腱病變中的疼痛和炎癥。這些發(fā)現(xiàn)揭示了iMSC-lEVs在免疫調(diào)節(jié)中的特殊作用，并強(qiáng)調(diào)了一種可改善肌腱病變和其他炎癥疾病的新型有效的無細(xì)胞療法。