骨骼肌萎縮是多種疾病的臨床癥狀之一，其特點是肌肉質(zhì)量和收縮功能的喪失，這會導(dǎo)致患者的生活質(zhì)量下降以及死亡率的上升。因此，了解萎縮性肌肉的細胞轉(zhuǎn)錄組特征對于探索肌萎縮的分子機制和制定相應(yīng)的治療策略至關(guān)重要。本文中，研究者利用單細胞核轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)描繪了失神經(jīng)肌肉纖維的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，確定了肌肉組織中細胞群體獨特的萎縮反應(yīng)基因特征，并揭示了失神經(jīng)肌肉纖維和其他駐留細胞中未描述的多樣性，為治療失神經(jīng)或其他相關(guān)分解代謝因素引起的肌肉萎縮提供了潛在的細胞和分子靶點。

文章詳情

文章題目：Decoding the transcriptome of denervated muscle at single-nucleus resolution

中文題目：單細胞核轉(zhuǎn)錄組測序解析失神經(jīng)肌肉的轉(zhuǎn)錄組

發(fā)表時間：2022.06

期刊名稱：J Cachexia Sarcopenia Muscle

影響因子：12.190

實驗平臺：10x Chromium單細胞核轉(zhuǎn)錄組測序、IHC

DOI：10.1002/jcsm.13023

 

研究思路

研究內(nèi)容

• 正常和失神經(jīng)肌肉的異質(zhì)性和細胞類型組成

為了研究萎縮和肌肉細胞異質(zhì)性之間的關(guān)系，研究者構(gòu)建小鼠坐骨失神經(jīng)模型（導(dǎo)致I型和II型肌纖維嚴重萎縮），并收集腓腸肌樣品進行10x 單細胞核轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得29539個細胞核轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（正常3只，模型3只），聚類后得到30個clusters，注釋成12種已知細胞類型。在正常組織中，II型肌核比例最高。失神經(jīng)后，I和II型肌核、內(nèi)皮細胞和周細胞比例降低，纖維成脂祖細胞（FAP）、巨噬細胞和未分類細胞核比例上升。其中，未分類細胞核表達多種細胞類型的特征基因，可能是多個細胞譜系的混合群體。擬時序分析則在肌核、FAP和內(nèi)皮細胞發(fā)現(xiàn)細胞動態(tài)軌跡，失神經(jīng)延長了肌核的軌跡，而FAP和其他駐留細胞軌跡受到影響較小，表明失神經(jīng)導(dǎo)致肌纖維的轉(zhuǎn)錄和異質(zhì)性變化更為明顯。

Fig.1 正常和失神經(jīng)腓腸肌的核/細胞類型分類

• II型肌核異質(zhì)性對失神經(jīng)的反應(yīng)

擬時序分析進一步探究發(fā)現(xiàn)正常組織中，II型肌核呈從IIa延伸到IIx的連續(xù)軌跡，接下來是IIb1和IIb2。而在模型組中這一軌跡發(fā)生顯著變化，且IIb2型肌核比例的顯著增加，意味著在II型肌纖維中，失神經(jīng)促進了肌核向特化IIb2型核的轉(zhuǎn)變。差異比較分析和IHC染色揭示IIb1和IIb2型肌核存在于同一肌纖維中。失神經(jīng)后，IIb2型核中幾個肌萎縮相關(guān)基因，鈣信號、MAPK和HIPPO通路在失神經(jīng)的IIb2肌核中富集，GSEA表明涉及氧化磷酸化和缺氧的標志性基因集在正常IIb1肌核中豐富，而在失神經(jīng)IIb2肌核中下調(diào)。相反，帶有涉及TGF-β和MYC信號的基因的標志集在失神經(jīng)IIb2型肌核中顯著豐富。SCENIC分析在II型肌纖維中鑒定到147個活躍調(diào)節(jié)子，且所有肌核可以被劃分為預(yù)期的亞型，這與使用軌跡分析獲得的聚類結(jié)果一致。這些結(jié)果表明，在II型肌核中，失神經(jīng)激活了獨特的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，驅(qū)動了纖維類型特異性轉(zhuǎn)錄變化。

Fig.2 軌跡顯示了II型肌核轉(zhuǎn)錄的異質(zhì)性

Fig.3 正常和失神經(jīng)狀態(tài)下IIb2型肌核的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

失神經(jīng)的I型肌核的轉(zhuǎn)錄和異質(zhì)性改變

I型肌核軌跡分析發(fā)現(xiàn)其沒有節(jié)點和分支，說明異質(zhì)性低。受失神經(jīng)影響的I型核形成了與正常組不同的cluster，反映了失神經(jīng)對轉(zhuǎn)錄組的顯著改變。Kegg分析表明失神經(jīng)的I型肌核差異表達基因（DEG）與蛋白質(zhì)降解、自噬、AMPK、mTOR和胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等被證明與肌肉萎縮有重要關(guān)系的途徑有關(guān)。GSEA揭示I型肌核中脂肪酸代謝、氧化磷酸化等通路在正常組織中豐富但在失神經(jīng)組織中下調(diào)。SCENIC分析發(fā)現(xiàn)在正常I型纖維中優(yōu)勢基因調(diào)控網(wǎng)路中的調(diào)控子在失神經(jīng)中下調(diào)，而CEBP-β，δ，γ和ζ調(diào)節(jié)子被顯著激活，這與先前報道的C/EBPβ促進肌肉萎縮相關(guān)基因在癌癥惡病質(zhì)中的表達一致。

Fig.4 I型肌核對失神經(jīng)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

• 失神經(jīng)后肌核的代謝可塑性和異質(zhì)性

為了探究肌纖維的代謝異質(zhì)性和對失神經(jīng)的適應(yīng)性反應(yīng)，研究者使用Single-Cell-Meta-bolic-Landscape分析單細胞核轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，構(gòu)建了在I/II型肌核中檢測到的1401個代謝基因的UMAP圖譜，表明代謝特征對纖維類型的表型變化有很大影響。在正常肌肉中，代謝活性從氧化性I型肌核到糖酵解IIb型肌核呈逐漸下降趨勢，失神經(jīng)后，所有肌核都的代謝活動顯著下調(diào)，說明失神經(jīng)導(dǎo)致肌纖維代謝需求減少，即失神經(jīng)可以誘導(dǎo)肌肉進行實質(zhì)性的新陳代謝適應(yīng)。代謝基因表達下降在氧化肌核(I/IIa型)最大，糖酵解(IIb1/2)肌核最小，暗示氧化肌纖維的代謝狀態(tài)可能更容易受失神經(jīng)影響。

Fig.5 正常和失神經(jīng)肌肉的肌核代謝圖譜

• 失神經(jīng)FAP的異質(zhì)性和表型

對FAP進行軌跡分析，發(fā)現(xiàn)失神經(jīng)后，從主軌跡中形成了三個分支，暗示了FAP的轉(zhuǎn)錄變化。分析FAP三個亞群的正常和失神經(jīng)細胞基因的表達差異，發(fā)現(xiàn)在正常FAP中，富集了與肌肉發(fā)生、缺氧和代謝相關(guān)的特征，但都在失神經(jīng)FAP中下調(diào)。此外，作為對失神經(jīng)的反應(yīng)，這些亞群富集了不同的基因集。失神經(jīng)激活C2和C3 FAP以使其分別獲得促纖維化和促脂肪生成的特征。在正常和失神經(jīng)FAP中發(fā)現(xiàn)了297個活性調(diào)節(jié)子，失神經(jīng)導(dǎo)致正常FAP中最活躍的調(diào)節(jié)子被抑制，伴隨著其他調(diào)節(jié)子的適應(yīng)性激活，特別在C3中有超過120個調(diào)節(jié)子被強烈激活，其中一些特定的調(diào)節(jié)子可能驅(qū)動FAP的表型變化。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)C2 顯示出更高的STAT3調(diào)節(jié)蛋白活性，據(jù)報道可在失神經(jīng)期間促進肌纖維萎縮和纖維化，并且還發(fā)現(xiàn)了幾個新的調(diào)節(jié)子在失神經(jīng)后FAP中活性顯著增加，其作用有待進一步研究。

Fig.6 FAPs對失神經(jīng)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

• 失神經(jīng)肌肉中巨噬細胞的表達改變

在正常和失神經(jīng)肌肉中，巨噬細胞（MPs）是主要的炎性細胞，分為2個亞型：骨骼肌駐留和單核細胞來源MPs。在失神經(jīng)肌肉中，巨噬細胞總數(shù)增加且駐留型MPs的比例明顯升高。軌跡分析表明駐留型MPs產(chǎn)生了一個連續(xù)的軌跡，兩個clusters對應(yīng)正常和失神經(jīng)的駐留MPs。差異分析、富集分析和GSEA表明失神經(jīng)駐留MPs中與纖維化或免疫反應(yīng)相關(guān)的基因上調(diào)表達，涉及免疫反應(yīng)、趨化因子受體結(jié)合的基因集顯著豐富。SCENIC分析結(jié)果說明失神經(jīng)可能會增強肌肉駐留MPs的自我更新能力。

Fig.7 巨噬細胞對失神經(jīng)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

• 肌纖維與其他駐留細胞之間的通訊對失神經(jīng)的反應(yīng)

為了探究失神經(jīng)肌肉中細胞間互作關(guān)系，研究者利用配體受體互作分析在正常和失神經(jīng)肌肉中分別推斷出592和48個配體受體對，表明失神經(jīng)對細胞通訊有明顯的抑制作用。因為失神經(jīng)誘導(dǎo)的分解代謝信號是在肌纖維中啟動的，所以優(yōu)先考慮從肌纖維到駐留細胞的互作信號。正常I型肌纖維表達較高的Fgf1、Mapt、Angpt1等配體，而II型肌纖維表達較高的Vefga、Fgf13、Cadm1。失神經(jīng)配體受體相互作用顯著下降，反映失神經(jīng)減少了肌纖維對駐留細胞的影響。由于肌纖維分泌的Fgf1被認為是維持MuSCs功能的關(guān)鍵，結(jié)果表明，肌纖維中Fgf1的下調(diào)可能是導(dǎo)致MuSCs在失神經(jīng)過程中功能障礙的機制之一。然而，研究者也在失神經(jīng)的MuSCs中檢測到MAPK通路的激活：KEGG分析顯示失神經(jīng)的MuSCs富集MAPK信號通路，而SCENIC分析捕捉到作為MAPK通路靶向轉(zhuǎn)錄因子之一的Ets1調(diào)節(jié)子的激活。這些結(jié)果表明，其他的FGF家族成員可能參與了MuSCs中MAPK信號的激活反映了肌肉失神經(jīng)過程中MAPK信號的復(fù)雜調(diào)控。

使用相同的策略研究從駐留細胞到肌纖維的通信，發(fā)現(xiàn)在正常肌肉中有85對相互作用，在失神經(jīng)肌肉中有25對相互作用，表明失神經(jīng)也減少了從駐留細胞到肌纖維之間的通訊。在正常組織中預(yù)測到從巨噬細胞到I型肌纖維的互作，包括Itga4、Fn1、Ptprc和Tfrc間的互作，但是這些互作關(guān)系對被失神經(jīng)抑制。由于Tfrc已被證明對肌肉發(fā)育和新陳代謝至關(guān)重要，結(jié)果表明巨噬細胞可能在維持正常肌肉內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。失神經(jīng)刺激巨噬細胞中某些配體的表達，這可能對肌纖維產(chǎn)生異常影響。FAPs是最大的駐留細胞群，依賴于環(huán)境的變化，它們能夠分泌促肌生成因子和促萎縮因子，研究者鑒定到FAPs到II型肌纖維在正常組織中的交互作用，它們在失神經(jīng)影響下互作強度降低。綜上所述，失神經(jīng)抑制了肌肉細胞間的整體通訊，同時也刺激了駐留細胞中促萎縮因子的表達，這可能導(dǎo)致失神經(jīng)誘導(dǎo)的肌肉萎縮。

Fig.8 失神經(jīng)后肌纖維與其他駐留細胞之間的配體-受體相互作用

主要結(jié)論

本研究利用肌肉萎縮的坐骨失神經(jīng)小鼠模型，使用單細胞核轉(zhuǎn)錄組技術(shù)從正常和失神經(jīng)小鼠中生成腓腸肌的單核轉(zhuǎn)錄圖譜，共獲得29539個肌肉細胞核，被分為13個類型。其中，IIb型肌核進一步分為兩個亞群，命名為IIb1型和IIb2型肌核。失神經(jīng)損傷后，IIb2型肌核比例顯著增加。軌跡分析顯示，失神經(jīng)IIb2肌核明顯偏離正常IIb2肌核，表明該亞群在失神經(jīng)后經(jīng)歷了強烈的轉(zhuǎn)錄重編程。肌核的代謝圖譜顯示，大多數(shù)代謝途徑被失神經(jīng)影響而下調(diào)，而一些代謝信號，如谷胱甘肽代謝，在失神經(jīng)的IIb2型肌核中被特異性激活。研究者還探究了I型肌纖維、肌肉干細胞、纖維脂肪祖細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和周細胞的轉(zhuǎn)錄變化，并表征了它們對失神經(jīng)的特征反應(yīng)。通過預(yù)測細胞間的相互作用，觀察到肌纖維和肌肉駐留細胞之間的通訊因失神經(jīng)而減少。綜上所述，這些結(jié)果定義了與失神經(jīng)誘導(dǎo)的肌肉萎縮相關(guān)的肌核轉(zhuǎn)變、代謝重塑和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)重編程，并闡明了肌肉細胞對分解代謝反應(yīng)的異質(zhì)性和可塑性的分子基礎(chǔ)，為探索肌肉萎縮的分子機制奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

Lin, Hongchun et al.“Decoding the transcriptome of denervated muscle at single-nucleus resolution.”Journal of cachexia, sarcopenia and muscle, 10.1002/jcsm.13023. 20 Jun. 2022