各位老師大家好！新一期10×單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組常見Q&A又來了！上一期中，我們介紹了單細(xì)胞實驗開展前最需要了解的幾大問題（點擊閱讀）。這一期，我們將為大家介紹單細(xì)胞實驗環(huán)節(jié)中的質(zhì)控細(xì)節(jié)。

1. transcriptional bursting
首先，給大家介紹轉(zhuǎn)錄表達(dá)中的一個現(xiàn)象：轉(zhuǎn)錄爆發(fā)（Transcriptional bursting），是指基因會從沉默的狀態(tài)突然切換為激活態(tài)，啟動轉(zhuǎn)錄、并在短時間內(nèi)（通常不超過2-3min）急劇生成產(chǎn)生大量RNA；然后再次進入沉默的狀態(tài)。 我們都知道，基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)是有周期性的。當(dāng)基因的轉(zhuǎn)錄被激活時，mRNA的水平會突然上升，然后慢慢下降，而相應(yīng)的蛋白水平的變化會有一定的滯后。這種周期的頻率，以及每次波動的大小，在RNA分析中都會影響最終的表達(dá)量（可以是FPKM值、RPKM值）。這種周期性的轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，就是同transcriptional bursting有關(guān)。
 
2. 單細(xì)胞實驗整體流程
在bulk RNA測序過程中，由于RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增流程，會存在偏好性的問題。同樣的，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組實驗中也存在偏好性，如擴增、Drop-out rates（有部分高表達(dá)的mRNA 無法被擴增出來）、Transcriptional bursting、背景噪音、細(xì)胞周期與細(xì)胞大小、以及批次效應(yīng)帶來的偏好性。
單細(xì)胞實驗整體流程如下圖，接下來給大家詳細(xì)講解一下哪些實驗環(huán)節(jié)會帶來偏好性，以及如何發(fā)現(xiàn)和質(zhì)控。
2.1 細(xì)胞分離
我們在做單細(xì)胞測序的時候，首先要做細(xì)胞分離。細(xì)胞分離必須要在較短時間內(nèi)完成，否則會影響到細(xì)胞的狀態(tài)，甚至可能導(dǎo)致RNA從細(xì)胞中漏出。
從組織中分離出單細(xì)胞可能遇到的問題：
1、細(xì)胞分離的不徹底，存在多個細(xì)胞黏連到一起的情況；
2、細(xì)胞分離條件對所有細(xì)胞類型不適中，會對一些細(xì)胞造成損傷，使RNA溢出；
3、溢出的RNA，導(dǎo)致了背景信號；  
細(xì)胞分離過程可能會產(chǎn)生偏好性。例如分離出的細(xì)胞可能只是一些特定細(xì)胞。因此對于聚類的結(jié)果，要進行仔細(xì)檢查，以發(fā)現(xiàn)某一群細(xì)胞中特異表達(dá)的基因是否存在著會由細(xì)胞分離實驗所引起的高表達(dá)基因。中科有著專業(yè)的實驗團隊，可以選擇最優(yōu)的細(xì)胞分離方案，在保證細(xì)胞活率大于80%的同時，降低偏好性的影響。
 
2.2 細(xì)胞分選
在做細(xì)胞分選的過程中會遇到如下的問題：
1、現(xiàn)有的單細(xì)胞測序都會遇到有些drople可能是空的或者存在多個細(xì)胞；
2、對于細(xì)胞的類型也往往存在偏好性，如中性粒細(xì)胞等；
3、分選實驗持續(xù)時間過長會損害細(xì)胞，造成背景噪音；
因此，選擇合適的單細(xì)胞測序策略尤為重要。Chromium X相較之前的型號，額外增加了溫控系統(tǒng)，可以使整個系統(tǒng)始終在恒定條件下運行，降低批次效應(yīng)，提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。通過微流控系統(tǒng)將單個細(xì)胞與Gel Beads結(jié)合形成GEMs，細(xì)胞捕獲率65%，雙細(xì)胞捕獲率為0.4%/1000個細(xì)胞，上機一次運行的時間不超過18min。  
2.3 細(xì)胞裂解
在做單細(xì)胞測序之前，需要對GEMs中細(xì)胞進行裂解。不同的細(xì)胞組織，裂解條件也會不一樣，如果裂解條件過于嚴(yán)格，就會影響文庫制備。中科單細(xì)胞實驗團隊會根據(jù)不同細(xì)胞類型選擇合適的裂解條件，確保后續(xù)文庫制備正常。
 
2.4 反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增
在GEMs中細(xì)胞裂解后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄（RT），形成10×Bacoded cDNA，
再進行PCR擴增，質(zhì)控要求cDNA總量＞100ng（濃度＞2.22ng/μl），片段分布在500bp-3000bp。由于不同細(xì)胞的擴增條件是不同的，但是在單細(xì)胞在擴增時的擴增條件單一，必然就會使得不同細(xì)胞的擴增效率存在不同，此外，PCR本身循環(huán)擴增過程中也會存在bias。但得益于Gel Beads中的UMI（對基因絕對定量），無論基因被擴增多少次，只對UMI計數(shù)一次，這消除了PCR擴增帶來的偏好性。
2.5 文庫構(gòu)建和測序
對構(gòu)建好的單細(xì)胞文庫進行質(zhì)檢，文庫濃度一般比cDNA濃度高出10倍以上。片段分布在300-600bp，主峰落在450bp左右。最后將質(zhì)檢合格的文庫上機測序，整個單細(xì)胞實驗環(huán)節(jié)到此就結(jié)束了！
總結(jié)
相信大家閱讀完以上內(nèi)容，已經(jīng)對單細(xì)胞測序整體實驗流程的質(zhì)控細(xì)節(jié)有一定了解了。下一期會給大家?guī)�來分析環(huán)節(jié)的質(zhì)控內(nèi)容，敬請期待！