隨著納米二氧化鈦材料 (nTiO₂)在各種工業(yè)產(chǎn)品中的廣泛生產(chǎn)和使用，人們?nèi)找骊P(guān)切其對環(huán)境造成的潛在的生態(tài)和健康風(fēng)險。研究表明，nTiO₂在紫外照射下產(chǎn)生的活性氧對微生物產(chǎn)生不利的生物效應(yīng)，但也有報道指出，在黑暗中長期接觸nTiO₂可誘導(dǎo)細菌細胞壁增厚和生物膜形成，促進微生物適應(yīng)環(huán)境。因此，nTiO₂對微生物造成何種影響，需要深入而細致的探討。
 

2022年3月，來自湘潭大學(xué)的張鵬研究團隊在Journal of Hazardous Materials （IF 14.224）上發(fā)表題為”Quantitative proteomics and phosphoproteomics elucidate the molecular mechanism of nanostructured TiO₂-stimulated biofilm formation”的文章，該研究整合蛋白質(zhì)組學(xué)與磷酸化修飾組學(xué)探討微生物適應(yīng)納米材料的分子機制。本研究發(fā)現(xiàn)，nTiO₂顯著改變活性污泥中菌群結(jié)構(gòu)，其中大腸桿菌可通過形成生物膜適應(yīng)亞致死的nTiO₂。中科新生命為其提供了蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化修飾組學(xué)技術(shù)服務(wù)。

研究材料

nTiO₂，Escherichia coli K12

 

技術(shù)路線

步驟1：nTiO₂選擇性富集細菌病原體并增加微生物群落的多樣性；

步驟2：nTiO₂脅迫下大腸桿菌蛋白質(zhì)組學(xué)及磷酸化修飾組學(xué)分析；

步驟3：nTiO₂通過增強鐵的吸收促進生物膜的生成；

步驟4：nTiO₂通過增強轉(zhuǎn)錄和翻譯過程提高大腸桿菌對抗菌劑適應(yīng)性；

步驟5：nTiO₂通過CsgD的去磷酸化增加了生物膜的生成。

 

研究結(jié)果
 

1. nTiO₂選擇性富集細菌病原體并增加微生物群落的多樣性

研究人員向活性污泥中分別添加0、5、50 mg/L nTiO₂，30h后觀察脅迫條件下生物膜的生長情況。結(jié)果顯示，隨著時間的推移，生物膜生物量逐漸增加，并且暴露于nTiO₂的活性污泥具有更高的細菌豐度和群落多樣性。尤其是一些條件致病菌豐度顯著增加，如腸桿菌屬、乳球菌屬等。總之，nTiO₂暴露顯著改變了活性污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)，促進了生物膜的形成。

圖1 nTiO₂對活性污泥生物膜形成及菌群豐度的影響

 

2. nTiO₂脅迫下大腸桿菌蛋白質(zhì)組學(xué)及磷酸化修飾組學(xué)分析

為了解析nTiO₂促進生物膜形成的機制，研究選取大腸桿菌分析了nTiO₂暴露引起的蛋白表達及磷酸化修飾層面的變化。蛋白質(zhì)組學(xué)及磷酸化修飾組分別鑒定到2937個蛋白和350個磷酸化肽段和741個修飾位點。GO和KEGG分析顯示，上調(diào)表達的蛋白中顯著富集鐵轉(zhuǎn)運和維持鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)通路，以及核糖體蛋白和RNA聚合酶亞基蛋白。這些結(jié)果表明，nTiO₂脅迫影響了細菌對鐵元素的利用，增強了RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯過程，可能影響細菌對轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成抑制類抗生素的耐藥性。

圖2 不同濃度nTiO₂作用于大腸桿菌9h后的多組學(xué)分析


圖3 nTiO₂暴露組與對照組的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

 

3.  nTiO₂通過增強鐵的吸收促進生物膜的形成

通過對暴露于50mg/L nTiO₂下的大腸桿菌生物膜進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)對鐵元素有高親和力的大腸桿菌素合成蛋白以及鐵元素轉(zhuǎn)運蛋白表達上調(diào)明顯，研究者猜測nTiO₂促進細菌對鐵的利用來增強對環(huán)境的適應(yīng)性。因此，研究人員利用三價鐵螯合物來驗證鐵元素對nTiO₂脅迫下生物膜生長的影響。實驗表明，外源鐵螯合劑干擾了細菌對鐵的吸收，破壞了生物膜的發(fā)育，這進一步證明了nTiO₂通過增強鐵的吸收促進生物膜的生成。
 

圖4 nTiO₂對微生物鐵獲取系統(tǒng)的影響

 

4. nTiO₂通過增強轉(zhuǎn)錄和翻譯過程提高大腸桿菌對抗菌劑適應(yīng)性

為了深入探究大腸桿菌是否通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯過程來響應(yīng)nTiO₂脅迫，研究人員在細菌培養(yǎng)基中添加不同類型的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成抑制劑，分析nTiO₂對大腸桿菌適應(yīng)性的影響。結(jié)果顯示，蛋白合成抑制劑四環(huán)素處理下的nTiO₂暴露組生物膜含量與對照組相當(dāng)，表明蛋白質(zhì)合成過程并未參與調(diào)控大腸桿菌對nTiO₂脅迫下的適應(yīng)性。而轉(zhuǎn)錄抑制劑利福平處理下nTiO₂暴露組生物膜含量顯著高于對照組，表明nTiO₂通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程增加大腸桿菌的適應(yīng)性。nTiO₂處理導(dǎo)致利福平的靶標(biāo)蛋白RpoB磷酸化修飾顯著下調(diào)，這一調(diào)控是nTiO₂提高大腸桿菌對轉(zhuǎn)錄抑制劑耐藥性的主要機制。

圖5 大腸桿菌對蛋白質(zhì)合成抑制劑及轉(zhuǎn)錄抑制劑的耐藥性研究

 

5. nTiO₂通過CsgD的去磷酸化增加了生物膜的生成

CsgD是已報道的調(diào)控大腸桿菌生物膜形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，調(diào)控胞外多糖、菌毛和纖維素的合成，而纖維素作為線性多糖聚合物，是生物膜形成的重要保護支架。本研究組學(xué)結(jié)果顯示，nTiO₂處理誘導(dǎo)CsgD磷酸化修飾水平顯著下調(diào)，而生物膜合成有關(guān)的BcsB、BcsZ、BcsC、SecG和SesY等在蛋白水平顯著上調(diào)。去磷酸化形式的CsgD可特異性結(jié)合到adrA啟動子區(qū)域并激活器其轉(zhuǎn)錄，而通常AdrA通過上調(diào)環(huán)二鳥苷酸水平介導(dǎo)BcsBAZC等蛋白合成纖維素�？傊�，nTiO₂誘導(dǎo)的CsgD蛋白磷酸化修飾變化，介導(dǎo)了大腸桿菌生物膜形成的調(diào)控過程，從而影響大腸桿菌對亞致死濃度的nTiO₂適應(yīng)性。

圖6 nTiO₂對生物膜基質(zhì)形成過程中細胞外組分的影響

 

 小編小結(jié)

盡管納米材料和微生物之間的相互作用具有廣泛的生態(tài)和健康影響，但微生物對納米材料的適應(yīng)機制仍不清楚。本研究中，在黑暗條件下暴露于nTiO₂的活性污泥中形成的生物膜生物量增加，并選擇性地富集病原體。蛋白質(zhì)多組學(xué)分析結(jié)果表明，nTiO₂脅迫進一步導(dǎo)致條件致病菌的鐵載體過表達，通過相關(guān)轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白的去磷酸化增強其耐藥性。nTiO₂會促進生物膜的生成，提高致病菌的適應(yīng)性，從而會加速生物污染，導(dǎo)致潛在的生態(tài)和健康風(fēng)險。