上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 課題組長

 

中國“腦計(jì)劃”已于2021年底開始實(shí)施，成為繼美國的“BRAIN Initiative”，歐洲的“Human Brain Project”和日本的“Brain/MINDS”之后，推動腦科學(xué)研究的又一重要舉措。各國“腦計(jì)劃”的一個(gè)核心目標(biāo)是——理解大腦的神經(jīng)活動如何塑造認(rèn)知和產(chǎn)生行為。

 

     1. 神經(jīng)元集群     

 

什么樣的神經(jīng)活動能夠恰當(dāng)?shù)胤从炒竽X功能？

經(jīng)典的神經(jīng)元學(xué)說(neuron doctrine)提出單個(gè)神經(jīng)元是大腦的功能單位。然而，單個(gè)神經(jīng)元常表現(xiàn)明顯的活動不穩(wěn)定性和功能多變性，對相同的外界刺激往往有顯著的差異反應(yīng)（視頻1），難以成為大腦的功能單位。

由于神經(jīng)元并非孤立存在，它們可直接或間接地經(jīng)由物理連接(如突觸)與其它神經(jīng)元形成多樣的功能結(jié)構(gòu)；于是神經(jīng)元集群(ensemble)、集合 (assembly)及印記(engram)等相近的功能概念被提出。集群概念與神經(jīng)環(huán)路側(cè)重于物理連接不同，更偏重于描述同一腦區(qū)內(nèi)能夠被反復(fù)地共同激活的一群神經(jīng)元^{[1, 2]}。

 

集群有何特征？

構(gòu)成集群的神經(jīng)元在空間上可分散分布，也不必具備完全相同的功能偏好^{[3, 4]}，但它們的集體活動模式可編碼大腦對外界刺激(如光帶的朝向和運(yùn)動)或內(nèi)在狀態(tài)(如對某場景的恐懼記憶)的應(yīng)答。如今，集群作為大腦的基本功能單位的假說正被接受^{[1, 2]}。本文將以小鼠為模型簡要闡述集群的活動及功能研究。

 

     2.神經(jīng)元集群研究方法     

 

首先如何找到集群？

目前尚未發(fā)現(xiàn)明顯的集群分子標(biāo)記，說明集群的形成很可能由神經(jīng)元的互作模式?jīng)Q定^[1]，與譜系及遺傳特征關(guān)系不大。因此集群的確定需要同時(shí)記錄一大群神經(jīng)元各自的活動軌跡，這限制了傳統(tǒng)的膜片鉗或微電極記錄方法的使用。

如何高效準(zhǔn)確地同時(shí)記錄大量神經(jīng)元的活動？研究人員根據(jù)神經(jīng)元電活動導(dǎo)致的物理化學(xué)變化(如膜電位升高、鈣離子內(nèi)流、基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)等)，開發(fā)了不同的手段。

其中，針對大量神經(jīng)元的電壓變化進(jìn)行成像是最直接的方法。目前有不少電壓指示劑(染料或蛋白)能夠根據(jù)神經(jīng)元電壓變化而改變熒光信號強(qiáng)度，可用于檢測動作電位及閾下電位^[5]。然而，電壓成像雖擁有近乎完美的時(shí)間分辨率，卻常受限于極低的信噪比(圖2)，暫時(shí)難以在大腦功能研究中推廣。

圖2. 電壓成像：電壓敏感指示蛋白的熒光變化能夠反映神經(jīng)元胞體和樹突快速的電壓變化(A)，但信噪比低(B)

(修改自Adam, Nature, 2019)

神經(jīng)元被激活會導(dǎo)致一系列即刻早期基因(immediate early gene，IEG)，如c-fos、Arc等快速轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。通過檢測IEG或者由它們的啟動子所驅(qū)動的熒光蛋白的表達(dá)，可標(biāo)記于同一時(shí)段內(nèi)被激活的神經(jīng)元(圖3)。該方法適用于在全腦范圍高效標(biāo)記集群^[6]，但局限于較低的時(shí)間分辨率(mRNA，約數(shù)分鐘; 蛋白，約數(shù)小時(shí))，難以準(zhǔn)確關(guān)聯(lián)集群功能及行為。

圖3. 即刻早期基因介導(dǎo)的活性標(biāo)記：即刻早期基因的快速轉(zhuǎn)錄及翻譯可用于標(biāo)記被激活的神經(jīng)元

(修改自Zelikowsky, J Neurosci, 2014; Tayler, Curr Biol, 2013)

鈣(離子)成像是目前確定集群及研究其活動的主流技術(shù)選擇。由于神經(jīng)元的動作電位發(fā)放顯著提高其胞體的游離鈣離子濃度，使用對鈣離子濃度高度敏感的熒光染料或蛋白，即可通過捕捉其熒光變化間接檢測神經(jīng)元的活動(圖4)。

雖然鈣離子濃度變化慢于電壓變化，致使鈣成像不如電壓成像般有毫秒級別的時(shí)間分辨率，但其熒光信號足夠強(qiáng)及穩(wěn)定，因而被廣泛用于腦內(nèi)集群的功能研究^[7]。

以上方法各有優(yōu)劣，本文將就鈣成像進(jìn)行闡述。

圖4. 鈣成像：根據(jù)對鈣離子敏感的染料(A)或指示蛋白(B)的熒光變化(C)，檢測大量神經(jīng)元的電活動

(修改自 方偉群，Cell Rep, 2017; 及未發(fā)表數(shù)據(jù))

鈣成像如何幫助記錄集群活動？

首先需要使用特異結(jié)合鈣離子的熒光指示劑或蛋白探針標(biāo)記大量神經(jīng)元。該目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)可通過將具有細(xì)胞滲透性的熒光染料(如OGB1等) 注射入腦內(nèi)(圖4)，或通過病毒介導(dǎo)將鈣指示蛋白(如GCaMP或jRGECO等)表達(dá)于腦內(nèi)神經(jīng)元(圖4)，或使用編碼GCaMP的轉(zhuǎn)基因小鼠(如Thy1-GCaMP6f或TIGRE等；圖5)。 

圖5. GCaMP6f轉(zhuǎn)基因小鼠：轉(zhuǎn)基因小鼠穩(wěn)定表達(dá)鈣指示蛋白用于鈣成像

(修改自Scott, Neuron, 2018)

 

     3.神經(jīng)元集群的功能成像、分析和干預(yù)     

 

接下來需要解答的是如何實(shí)時(shí)捕捉神經(jīng)元的熒光變化?

可通過單光子，雙光子乃至三光子顯微成像系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。由于大腦對長波長的光(如紅外光)散射較少，隨著單、雙及三光子系統(tǒng)所采用的激發(fā)光波長遞增，它們的成像深度也大體遞增。

因此，普通的單光子系統(tǒng)(如共聚焦顯微鏡)通常適用于對很淺層的腦組織成像，或通過植入光纖對深部腦區(qū)和核團(tuán)成像，但受限于較低的空間分辨率。而相對于單光子成像，雙光子鈣成像具有更深的穿透力，更高的光收集效率和更小的光毒性，成為目前腦內(nèi)在體鈣成像的主流方法。通過配合GRIN透鏡的使用，雙光子系統(tǒng)可探測深部腦區(qū)，提供高時(shí)空分辨率的鈣影像（圖6）。三光子系統(tǒng)的成像深度可超過1mm，為直接無創(chuàng)觀測深部皮層的集群帶來很大便利(圖6)，但目前仍未得到廣泛應(yīng)用^[8]。本文將就雙光子鈣成像進(jìn)行闡述。

圖6. 大腦深部鈣成像：使用GRIN透鏡的雙光子成像(A)及三光子顯微成像(B)可對深部腦區(qū)進(jìn)行高分辨率鈣成像

(修改自Jennings, Nature, 2019; Hontani, Sci Adv, 2021）

雙光子鈣成像如何用于研究集群功能？
集群的活動反映其功能。但即便小鼠處于黑暗、安靜和熟悉的環(huán)境中并保持靜止，其各腦區(qū)的神經(jīng)元仍有非�；钴S的自發(fā)放電活動，研究者將難以確定該條件下集群的具體功能。

因此，為了準(zhǔn)確判定集群功能，應(yīng)將小鼠置于具體的情境或行為之下，并實(shí)時(shí)捕捉其大量神經(jīng)元的活動軌跡。由于集群對刺激、環(huán)境和行為的反應(yīng)存在動態(tài)變化，研究者還應(yīng)較長時(shí)間地記錄集群的鈣活動，從中歸納出神經(jīng)活動的模式，判定集群的功能偏好及特異性等。

以初級視皮層的layer2/3錐體細(xì)胞為例，我們發(fā)現(xiàn)給予小鼠特定模式的視覺刺激(如特定朝向的移動光柵)，能夠激活相似的一群神經(jīng)元，而這群神經(jīng)元對其它朝向的移動光柵反應(yīng)明顯較弱。因此，這群神經(jīng)元組成一個(gè)偏好該朝向視覺刺激的集群。這個(gè)集群在不同時(shí)間對不同朝向的活動強(qiáng)度反映了它的功能選擇性，可被定量分析(圖7)。

圖7. 集群功能判定：集群對特定視覺特征的功能偏好及選擇性可被定量分析

(方偉群，未發(fā)表數(shù)據(jù))

在體雙光子鈣成像結(jié)果能夠提示集群功能與認(rèn)知及行為的相關(guān)性，還需再結(jié)合集群調(diào)控技術(shù)(如光遺傳學(xué)等)，驗(yàn)證二者的因果關(guān)系。

然而，傳統(tǒng)的光遺傳學(xué)調(diào)控方式存在明顯缺陷：

1) 常采取面刺激方式，在短時(shí)間內(nèi)無差別地激活或抑制表達(dá)光敏蛋白的大量神經(jīng)元，其強(qiáng)度遠(yuǎn)高于生理狀態(tài)下的神經(jīng)活動強(qiáng)度，很可能造成假象；

2) 雖然采用遺傳標(biāo)記等方法可僅在特定細(xì)胞類型中表達(dá)光敏蛋白，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞類型或投射的特異性干預(yù)，但對于相鄰的同類型神經(jīng)元仍無能為力。雙光子光遺傳學(xué)解決了這一難題(圖8)，比如通過使用空間光調(diào)節(jié)器(spatial light modulator, SLM)將一束激光分為若干小光束，而每一小光束僅聚焦于同一集群的特定神經(jīng)元上，同時(shí)激活或抑制它們。

再結(jié)合使用定位于胞體的鈣離子探針和光敏蛋白，可進(jìn)一步減少由于神經(jīng)突起交錯導(dǎo)致的非特異性刺激。因此，雙光子光遺傳學(xué)可實(shí)現(xiàn)對任意神經(jīng)元的光刺激，精準(zhǔn)地調(diào)控集群^[9]。

圖8. 雙光子同步鈣成像及光遺傳學(xué)：雙光子光遺傳學(xué)刺激(A)，結(jié)合胞體定位的鈣指示蛋白(B)和光敏蛋白(C)，可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)鈣成像和活性調(diào)控

(修改自Yang, eLife, 2018; Shemesh, Nat Neurosci, 2017; Shemesh, Neuron, 2020）

雙光子技術(shù)調(diào)控的集群功能是否反映認(rèn)知及行為？

以初級視皮層的研究為例，研究者可根據(jù)雙光子鈣成像的結(jié)果，確定編碼特定視覺特征(如光柵的朝向)的集群，再以雙光子光遺傳學(xué)技術(shù)特異地激活該集群，對小鼠植入假的視覺信號，活化其下游的環(huán)路，使小鼠誤認(rèn)為接受到特定指令而啟動視覺誘發(fā)的飲水行為(圖9)^[10]。

在另一例子中，作者采用類似的“全光學(xué)”雙光子成像和調(diào)控系統(tǒng)，識別及激活海馬體中的位置細(xì)胞集群，改變小鼠的空間記憶(圖10)^[11]。此類研究證明了精準(zhǔn)地操縱特定集群的活動可改變小鼠的認(rèn)知及行為。

圖9. 集群與視覺感知：雙光子光遺傳學(xué)激活視覺皮層神經(jīng)元集群(A)，誘發(fā)視覺感知及視覺引導(dǎo)行為(B) 

(修改自Marshel, Science, 2019）

 

圖10. 集群與空間記憶：雙光子“全光學(xué)”成像及調(diào)控系統(tǒng)(A)能夠精準(zhǔn)激活海馬體中的位置細(xì)胞集群，改變小鼠的空間記憶(B) 

(修改自Zhang, Nat Methods, 2018; Robinson, Cell, 2020）

以上對集群的功能成像、分析和干預(yù)是依次分別開展的，并非最理想的選擇。能否做到三個(gè)步驟同步進(jìn)行，即所謂“閉環(huán)”操縱集群^[12]？

這要求系統(tǒng)能夠 “在線”實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的活性捕捉，快速的功能判定和高效的活性調(diào)控。這樣的閉環(huán)系統(tǒng)可以迅速反映集群與行為的即時(shí)關(guān)聯(lián)，并及時(shí)反饋，調(diào)控集群而改變行為，很可能是研究集群功能與行為的最佳方案(圖11)^{[12, 13]}。

在這樣的方案下，研究者可選擇性地激活特定一群神經(jīng)元，重現(xiàn)或改變原有集群的活動模式，甚至設(shè)計(jì)構(gòu)建新的集群，實(shí)現(xiàn)模擬、植入乃至矯正認(rèn)知的目的，有望為正常及疾病大腦的神經(jīng)機(jī)制研究提供獨(dú)特視角和工具。

圖11. 雙光子“閉環(huán)”系統(tǒng)能夠同步讀寫集群活動，操控動物行為

(修改自Hausser, N Engl J Med, 2021）

 

     4. 神經(jīng)元集群與神經(jīng)疾病     

 

由此引出一個(gè)新問題，集群變化是否可作為腦疾病的神經(jīng)病理指標(biāo)？

由于雙光子系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確定位集群的構(gòu)成神經(jīng)元的空間分布，精準(zhǔn)追蹤及改變其活動軌跡，使得集群的結(jié)構(gòu)和功能具備高度可定量性。集群的功能判定是基于特定情境和行為下神經(jīng)元的集體活動模式，反映了神經(jīng)元之間的功能互作，提示集群變化或許可作為神經(jīng)環(huán)路功能的內(nèi)表型(endophenotype)。

確實(shí)，集群在腦疾病(如自閉癥，精神分裂等)小鼠模型中產(chǎn)生明顯變化^{[4, 14]}，與采用其它腦功能檢測技術(shù)(如fMRI，微電極陣列等)得到的結(jié)論吻合。但是，目前對腦疾病模型中集群的研究仍處于特征描述階段，未能有效調(diào)控集群，重現(xiàn)或逆轉(zhuǎn)疾病癥狀。因此，集群變化是否可作為腦疾病的重要貢獻(xiàn)因素，其充分性和必要性都尚未得到深入探究。

為了更好揭示集群與認(rèn)知和行為的關(guān)系，有必要闡明集群的運(yùn)行和演進(jìn)機(jī)制。我們需要了解集群的結(jié)構(gòu)及功能如何形成與發(fā)展，存在何種可塑性和關(guān)鍵期，有何獨(dú)特的細(xì)胞互作機(jī)制，同一腦區(qū)功能相關(guān)的集群如何競爭(competition)、互補(bǔ)(complementation)、分離 (separation)和整合(integration)，以及不同腦區(qū)的上下游集群如何溝通信息。

通過對集群機(jī)制的研究，我們有望驗(yàn)證：操控集群功能是否可以重現(xiàn)或逆轉(zhuǎn)疾病的核心表型。這些問題也是本課題組的研究興趣所在。我們有理由相信，基于集群成像的高時(shí)空分辨率及光調(diào)控的精準(zhǔn)性，對集群的深入研究將有助于在介觀層面解析神經(jīng)環(huán)路的功能與可塑性，助力對大腦運(yùn)行規(guī)律的解碼，使人類更懂得人類。

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