貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)

（１）貼壁細(xì)胞的復(fù)蘇

在準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)提前做好一下兩點(diǎn)準(zhǔn)備：1.提前把超凈工作臺(tái)紫外滅菌30分鐘；2.提前把水浴鍋打開，使水溫保持在37攝氏度，并預(yù)熱復(fù)蘇細(xì)胞所用的培養(yǎng)基。上述準(zhǔn)備工作完成以后就可以從液氮中取出保存的細(xì)胞，本著“慢凍速融”的原則，把細(xì)胞放進(jìn)水溫３７攝氏度的水浴鍋中并不斷攪拌，使冷凍的細(xì)胞迅速融化，最大限度的保存細(xì)胞的活力，這個(gè)過(guò)程最好在兩分鐘之內(nèi)完成。細(xì)胞解凍后放在離心機(jī)中以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心3-5分鐘，離心結(jié)束小心棄去上清，并用提前預(yù)熱的完全培養(yǎng)基把細(xì)胞吹打混勻，再轉(zhuǎn)移至規(guī)格合適的培養(yǎng)器皿中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)即可。

（２）貼壁細(xì)胞的傳代

當(dāng)我們?cè)跍?zhǔn)備給貼壁細(xì)胞進(jìn)行傳代的時(shí)候應(yīng)該確認(rèn)以下兩點(diǎn)：1.先把細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)箱中拿出，放在顯微鏡下觀察，確保細(xì)胞狀態(tài)良好，沒有污染；2.觀察細(xì)胞的匯合度達(dá)到70%-90%，細(xì)胞匯合度太低或者太高時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代均不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。只有滿足這兩點(diǎn)基本條件，我們才能給細(xì)胞傳代。給細(xì)胞傳代時(shí)，首先我們棄去培養(yǎng)基，用pH=7.4的無(wú)菌的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗細(xì)胞2-3次，動(dòng)作要輕柔防止細(xì)胞脫落。清洗完細(xì)胞后再加入終濃度為0.25%的胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞，消化過(guò)程中把細(xì)胞放在顯微鏡下觀察，直到細(xì)胞被消化成一個(gè)一個(gè)單獨(dú)的小圓球時(shí)加入完全培養(yǎng)基終止細(xì)胞消化，消化時(shí)間要把握好，消化時(shí)間太短細(xì)胞沒有消化下來(lái)，時(shí)間太長(zhǎng)則會(huì)影響細(xì)胞活性。消化下來(lái)的細(xì)胞吹打混勻后以1:3-5的比例分裝到新的培養(yǎng)器皿中再加入足量的完全培養(yǎng)基繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。

（３）貼壁細(xì)胞的凍存

凍存細(xì)胞時(shí)，首先我們棄去培養(yǎng)基，用pH=7.4的無(wú)菌的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗細(xì)胞2-3次，動(dòng)作要輕柔防止細(xì)胞脫落。清洗完細(xì)胞后再加入終濃度為0.25%的胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞，消化過(guò)程中把細(xì)胞放在顯微鏡下觀察，直到細(xì)胞被消化成一個(gè)一個(gè)單獨(dú)的小圓球時(shí)加入完全培養(yǎng)基終止細(xì)胞消化，消化下來(lái)的細(xì)胞吹打混勻后，按照以下比例混勻放入凍存管中：60%的胎牛血清（FBS）＋30％細(xì)胞懸液＋10%二甲基亞砜（DMSO）。特別值得注意的是，在凍存管上要標(biāo)注清楚凍存的細(xì)胞名稱，細(xì)胞凍存的時(shí)間，凍存細(xì)胞的代數(shù)等信息。本著“慢凍速融”的原則，我們把寫好信息的凍存管放入慢凍盒中，放入負(fù)八十度冰箱冷藏十二個(gè)小時(shí)后再把細(xì)胞取出放入液氮中保存。

貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

在準(zhǔn)備做細(xì)胞轉(zhuǎn)染的前一天我們把細(xì)胞鋪進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，使得細(xì)胞匯合度達(dá)到百分之六十到百分之八十。在轉(zhuǎn)染前需要把完全培養(yǎng)基換成無(wú)雙抗的完全培養(yǎng)基，以排除雙抗對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。根據(jù)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)不同選取適量的純培養(yǎng)基分別稀釋質(zhì)粒和lipo3000，其中稀釋完的質(zhì)粒中加入p3000充分混勻后再加入稀釋過(guò)的lipo3000中，把混合液輕柔的吹打混勻，室溫孵育20分鐘。孵育結(jié)束后把質(zhì)粒-p3000-lipo3000混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，然后再輕輕搖勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6個(gè)小時(shí)，再更換成帶有雙抗的完全培養(yǎng)基即可。