前言

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是用于擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（以下簡(jiǎn)稱(chēng)qPCR）作為第二代PCR技術(shù)，自1996年推出以來(lái)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原微生物檢測(cè)、動(dòng)植物育種等許多研究領(lǐng)域，為了獲得最理想的檢測(cè)結(jié)果，qPCR從樣本采集、核酸提取、cDNA合成到上機(jī)檢測(cè)的流程有許多可以?xún)?yōu)化的參數(shù)。

qPCR實(shí)驗(yàn)的工作流程首先需要確定研究的目的，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)規(guī)劃好實(shí)驗(yàn)分組、重復(fù)次數(shù)等細(xì)節(jié)。接下來(lái)分為樣本準(zhǔn)備和引物探針驗(yàn)證兩個(gè)重要的步驟。樣本準(zhǔn)備主要是核酸提取逆轉(zhuǎn)錄等步驟，引物探針需要去測(cè)試特異性和效率。接下來(lái)需要使用qPCR儀來(lái)對(duì)樣品中的目的核酸進(jìn)行擴(kuò)增qPCR結(jié)束后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?duì)目的核酸進(jìn)行相對(duì)或者絕對(duì)定量。接下來(lái)講的qPCR體系優(yōu)化會(huì)圍繞著這個(gè)流程展開(kāi)。

1.樣本的采集與處理

首先，提前做好功課，了解樣本的不同分型，或者了解詳細(xì)的細(xì)胞分群。如果條件允許盡可能覆蓋所有的組織類(lèi)型或者細(xì)胞類(lèi)型。其次，盡可能增加樣本數(shù)量，也就是生物學(xué)重復(fù)，從而更客觀地反映生物變異程度。另外，qPCR實(shí)驗(yàn)也需要有技術(shù)重復(fù)來(lái)降低誤差。

采樣是需要嚴(yán)格規(guī)劃的過(guò)程，比如材料的時(shí)效性、珍貴程度等，都要納入考量范圍。樣品要盡量新鮮，取樣盡可能快速。戴手套操作，防止污染。如果不馬上提取核酸，需要-80°C保存，并盡快處理。
 

2.核酸的提取和檢測(cè)

模板的質(zhì)量直接影響到檢測(cè)性能。核酸提取需要有效地將RNA或DNA從其他混合物中分離。RNA樣本中的污染物——基因組DNA、DNA結(jié)合蛋白、酚類(lèi)化合物或在提取RNA過(guò)程中引入的外源雜質(zhì)(如手套中的粉末)——都已被證明會(huì)抑制下游實(shí)驗(yàn)，如逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。核酸提取需要使用無(wú)菌無(wú)酶的試劑耗材，避免RNase或DNase污染，并對(duì)內(nèi)源RNAse或DNAse進(jìn)行有效抑制；多糖多酚樣品要考慮多糖多酚雜質(zhì)的有效去除。低溫保存防止RNA或DNA降解。

降解或不純的RNA會(huì)限制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效率，降低產(chǎn)量。部分降解的RNA可能不能給出準(zhǔn)確的基因表達(dá)結(jié)果。對(duì)于基因的定量，必須使用高質(zhì)量的RNA，這意味著需要非常仔細(xì)地檢查RNA的濃度和質(zhì)量。可采用高分辨率瓊脂糖凝膠檢測(cè)核酸質(zhì)量和分光光度法（A260/A280=1.8和A260/A230=2.0）檢測(cè)核酸純度和濃度。

3.cDNA合成

RNA 質(zhì)量對(duì) cDNA 合成結(jié)果會(huì)產(chǎn)生重要影響。并且RNA 很脆弱，容易降解。為了保證 RNA 的完整性，我們需要非常注意，比如在冰上操作，用 RNase-free 的槍頭和離心管，減少操作時(shí)間等。在反應(yīng)體系中加入 RNase 抑制劑也能有效防止 RNA 降解。

如何評(píng)價(jià)樣品中的雜質(zhì)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的影響呢？可以梯度稀釋后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如果低濃度的樣品點(diǎn)數(shù)值偏大比較明顯，基本可以判定雜質(zhì)影響顯著。

不同廠家的反轉(zhuǎn)錄試劑會(huì)有差異，對(duì)RNA中的雜質(zhì)耐受程度也不同。逆轉(zhuǎn)錄酶在整個(gè)反轉(zhuǎn)錄體系中具有關(guān)鍵性影響。除了活性以外，逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性同樣很重要，在較高溫度下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，能夠減少 RNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，增加逆轉(zhuǎn)錄的效率。

除了掌握 RNA 的完整性之外，反轉(zhuǎn)錄之前還需要對(duì) RNA 濃度進(jìn)行測(cè)定。一般反轉(zhuǎn)錄試劑盒會(huì)對(duì)上樣量有要求，建議 total RNA 上樣量小于 5 μg。超過(guò)這個(gè)范圍，會(huì)使反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生偏好性 (表達(dá)豐度高的基因優(yōu)先被反轉(zhuǎn)錄) 而造成定量結(jié)果不準(zhǔn)確。

逆轉(zhuǎn)錄出來(lái)的cDNA可以直接放在4°C保存，若長(zhǎng)期不用，可分裝，然后-20°C保存。

4.qPCR方法的建立

① 定量方法

絕對(duì)定量：檢測(cè)起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)，需要標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)品可以是純化的基因組DNA、質(zhì)粒DNA或者體外轉(zhuǎn)錄RNA(cDNA)，其作用是生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立Ct值與濃度之間的線性關(guān)系。

標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品的PCR效率一致，且接近100%，與樣品的性質(zhì)盡可能接近，與樣品相同的擴(kuò)增條件（PCR體系、耗材、同一次擴(kuò)增），大于或等于5個(gè)梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品。

相對(duì)定量：在一個(gè)樣本中，目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的量的變化。

內(nèi)參基因選擇建議篩選不少于三個(gè)內(nèi)參基因來(lái)歸一化RT-qPCR數(shù)據(jù)。目的是消除外部樣品偏差，例如總RNA含量，RNA穩(wěn)定性，酶效率或樣品裝載量的變化。

對(duì)候選的內(nèi)參基因進(jìn)行qPCR 實(shí)驗(yàn)，得出Ct平均值以及 Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，選擇SD最小的基因作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參�？赏ㄟ^(guò)geNorm 、 BestKeeper  、 NormFinder、RefGenes 等工具來(lái)評(píng)估您的內(nèi)參基因。

② 熒光標(biāo)記方法

染料法：利用能與DNA雙鏈結(jié)合的染料來(lái)實(shí)現(xiàn)，如SYBR Green I。該染料在游離狀態(tài)下呈現(xiàn)微弱的熒光，一旦與雙鏈DNA的雙螺旋小溝結(jié)合，其綠色熒光增強(qiáng)約1000倍。因此其總的熒光強(qiáng)度與雙鏈DNA含量成正比，利用這一關(guān)系可以反映生成的PCR產(chǎn)物的量。

TaqMan熒光探針：是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5'末端，而淬滅劑則在3'末端。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收; PCR擴(kuò)增時(shí), Tag酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。常用的熒光基團(tuán)是FAM，TET，VIC，HEX。

引物探針設(shè)計(jì)可以參考Gene π網(wǎng)站：https://www.gene-pi.com/item/primers-and-probes-2/

③  引物擴(kuò)增效率驗(yàn)證

標(biāo)準(zhǔn)曲線是評(píng)估PCR擴(kuò)增效率最可靠和穩(wěn)定的一種方法，該方法涉及到制作一系列的樣品來(lái)控制目標(biāo)模板的相對(duì)數(shù)量。最常用的是10倍梯度稀釋樣品，采用標(biāo)準(zhǔn)qPCR程序進(jìn)行擴(kuò)增獲得Cq值，最后根據(jù)各樣品濃度及相應(yīng)的Cq值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程Cq= -klgX0+b，擴(kuò)增效率E=10(-1/k)-1。利用qPCR進(jìn)行定量分析時(shí)，要求擴(kuò)增效率范圍在90%-110%（3.6＞k＞3.1）。

④  反應(yīng)體系優(yōu)化

▶  根據(jù)儀器類(lèi)型，選擇合適的耗材和qPCR試劑。

▶ 每對(duì)引物先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定特異性以及最適濃度。

▶  配置不同的PCR反應(yīng)體系，選擇每個(gè)組分合適的濃度。

▶  設(shè)置溫度梯度測(cè)試引物最合適的退火溫度。

▶  實(shí)驗(yàn)設(shè)置NTC、NRT、 NEG和POS等對(duì)照組，來(lái)監(jiān)控實(shí)驗(yàn)體系或污染。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR常見(jiàn)問(wèn)題分析

1.可疑的擴(kuò)增曲線

真正的擴(kuò)增曲線，有特征的形狀：首先背景信號(hào)，然后是三個(gè)增長(zhǎng)階段（指數(shù)增長(zhǎng)期、線性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期）。

如果不是同時(shí)具有特征性的三個(gè)增長(zhǎng)階段，沒(méi)有典型的指數(shù)增長(zhǎng)期，那就不存在擴(kuò)增。

平臺(tái)期很低也是常見(jiàn)的異常擴(kuò)增曲線�？赡苁悄０宓臐舛忍�低。通常如果模板的起始濃度太低, 反應(yīng)體系中會(huì)形成大量的引物二聚體。大量引物二聚體的形成使得引物很快消耗完，從而造成擴(kuò)增曲線的平臺(tái)期很低。這種情況可通過(guò)調(diào)整引物和模板的比例。

2.異常的熒光信號(hào)

NTC出現(xiàn)熒光信號(hào)---引物二聚體形成或氣溶膠污染，查看熔解曲線是否為單一峰。

3.擴(kuò)增效率過(guò)高或過(guò)低

過(guò)低的擴(kuò)增效率（<90％）可能存在的原因：

▶  移液器校準(zhǔn)不良或移液技術(shù)差。

▶ 不正確的稀釋導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線出現(xiàn)錯(cuò)誤。

▶  引物設(shè)計(jì)不好或擴(kuò)增子具有二級(jí)結(jié)構(gòu)。

▶  標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)態(tài)范圍太小。

▶  Taq酶無(wú)活性或活性降低。

▶  樣品抑制。

過(guò)高的擴(kuò)增效率（> 110％）可能存在的原因：

▶  移液器校準(zhǔn)不良或移液技術(shù)差。

▶ 不正確的稀釋導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線出現(xiàn)錯(cuò)誤。

▶  引物二聚體或非特異性擴(kuò)增。

▶  標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)態(tài)范圍太小。

▶  基因組DNA污染。

4.重復(fù)性差

為精確定量，對(duì)每個(gè)樣品都要做重復(fù)實(shí)驗(yàn)，復(fù)孔之間的Ct值不應(yīng)超過(guò)0.5，標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于0.2，這樣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果就有很好的精確度。

造成重復(fù)性差的原因：

▶  加樣誤差（操作或者加樣器導(dǎo)致）。

▶ 沒(méi)有將試劑和樣品充分混勻。

▶  低拷貝的目的片段→泊松分布。

▶  基線閾值設(shè)定不合理。

 

Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)

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