恒河猴感染COVID-19的分子機(jī)制及潛在治療藥物

瀏覽次數(shù)：863　發(fā)布日期：2022-8-12　來源：中科新生命

臨床組織是分子機(jī)制研究的首選樣本，但COVID-19臨床組織很少，且大多來自終末期患者的尸檢。動(dòng)物模型，尤其是非人靈長類動(dòng)物模型的建立，可為COVID-19相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

2022年1月北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院楊俊濤教授在Signal transduction and targeted therapy（IF 18.187）雜志上發(fā)表題目為“Proteomic and phosphoproteomic profiling of COVID-19-associated lung and liver injury: a report based on rhesus macaques”的研究成果，利用蛋白組學(xué)和磷酸化蛋白組學(xué)首次對(duì)感染SARS-CoV-2的恒河猴早期肺組織和肝組織分子變化進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究SARS-CoV-2的分子機(jī)制和藥物發(fā)現(xiàn)提供了有效的數(shù)據(jù)資源。

研究材料：
空白對(duì)照組和病毒感染組；SARS-CoV-2感染7天后的恒河猴肺、肝組織（n=8）

技術(shù)路線：
步驟1：肺、肝損傷表型分析
步驟2：蛋白組學(xué)分析
步驟3：差異蛋白PPI互作
步驟4：磷酸化蛋白組學(xué)分析
步驟5：激酶預(yù)測(cè)
步驟6：激酶與藥物整合預(yù)測(cè)

研究結(jié)果：

1. 恒河猴SARS-CoV-2感染后肺、肝損傷檢測(cè)
采用定量RT-PCR方法檢測(cè)感染恒河猴鼻、喉、肛門拭子中SARS-CoV-2 RNA含量，確定7天后SARS-CoV-2 病毒含量趨于穩(wěn)定（圖1a）。從胸片可直觀看到，病毒感染組恒河猴肺部間質(zhì)濾過和滲出性病變（圖1b）。與對(duì)照組相比，感染組恒河猴肺部有多個(gè)病理病變和出血點(diǎn)（圖1c）。進(jìn)一步定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，感染組恒河猴肝臟中的病毒載量低于肺部（圖1d）。從病理切片可以看到感染組恒河猴肺部有明顯的炎性細(xì)胞浸潤，肺間隔局部增厚，血管血栓形成；肝臟中肝竇間隙增寬、炎癥細(xì)胞散在浸潤（圖1e）。

圖1 恒河猴SARS-CoV-2感染及隨后肺、肝損傷的驗(yàn)證

2.恒河猴SARS-CoV-2感染后肺、肝組織蛋白組學(xué)分析
蛋白質(zhì)組學(xué)定量了肺中6715個(gè)蛋白和肝臟中5238個(gè)蛋白。主成分分析（PCA）結(jié)果顯示，對(duì)照組和病毒感染組之間肝臟蛋白表達(dá)譜的總體差異大于肺（圖2b，c）。與對(duì)照組相比，感染組肺組織和肝組織差異表達(dá)蛋白分別為757個(gè)和1219個(gè)（圖2d）。KEGG通路富集分析顯示，在感染組的肺組織中，核糖體、DNA復(fù)制、RIG- I樣受體或信號(hào)通路、錯(cuò)配修復(fù)等相關(guān)通路蛋白上調(diào)；與ECM -受體相互作用關(guān)系最為密切蛋白的下調(diào)（圖2e）。在感染組的肝臟組織中，核糖體、氨基�；�-tRNA生物合成、氧化磷酸化等相關(guān)通路蛋白上調(diào)；剪接體、調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和局部粘附等相關(guān)蛋白下調(diào)（圖2f）。

圖2 恒河猴SARS-CoV-2感染后肺、肝組織蛋白比較

3.差異蛋白PPI互作分析
將通路富集到的蛋白進(jìn)行蛋白相互作用（PPI）分析。肺部（圖3a）和肝臟（圖3b）在感染后均出現(xiàn)代謝相關(guān)蛋白和核糖體相關(guān)蛋白水平升高。結(jié)合KEGG和STRING數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)感染組肺組織RIG-I通路、蛋白加工、DNA復(fù)制和修復(fù)相關(guān)蛋白上調(diào)，肝組織氧化呼吸鏈和蛋白質(zhì)加工通路相關(guān)蛋白發(fā)生顯著變化。蛋白酶介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解在肺中活躍，但在肝臟中受到抑制（圖3c，d）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2感染7天后，局灶性粘連周圍蛋白呈下降趨勢(shì)。整合素α家族中的ITGA5和鏈接ECM和細(xì)胞骨架的DAG1在感染肺和肝臟組織中均下降（圖3c，d）。

圖3 差異蛋白互作分析

4. 恒河猴SARS-CoV-2感染后肺、肝組織磷酸化蛋白組學(xué)分析
磷酸化是細(xì)胞對(duì)刺激做出反應(yīng)的一種快速調(diào)節(jié)方法，已在一些SARS-CoV-2感染的細(xì)胞模型或尸檢樣本中檢測(cè)到。因此，作者分析了恒河猴肺和肝臟的磷酸化蛋白質(zhì)組，以期找到SARS-CoV-2感染期間的潛在藥物靶點(diǎn)。共定量了肺中4185個(gè)蛋白質(zhì)的12,418個(gè)磷酸位點(diǎn)和肝臟中3191個(gè)蛋白質(zhì)的8134個(gè)磷酸化位點(diǎn)。其中，肺部873個(gè)蛋白質(zhì)的1162個(gè)位點(diǎn)和肝臟712個(gè)蛋白質(zhì)中的960個(gè)位點(diǎn)差異表達(dá)。通路富集和PPI互作分析發(fā)現(xiàn)，肺中上調(diào)的磷酸化蛋白富集于代謝、剪接體和泛素介導(dǎo)的蛋白水解等途徑，而下調(diào)磷酸化蛋白與Fc-γ-R介導(dǎo)的吞噬、粘附連接和基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)（圖4a）。在肝臟中，上調(diào)的磷酸化蛋白富集于多種代謝途徑，而下調(diào)的磷酸化蛋白與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、剪接體、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)（圖4b）。PPI互作結(jié)果顯示，上調(diào)的磷酸化蛋白多于下調(diào)的磷酸化蛋白（圖4c，d）。

圖4 恒河猴肺、肝中差異磷酸化蛋白KEGG通路富集和PPI分析

5. 恒河猴SARS-CoV-2感染后肺、肝組織激酶預(yù)測(cè)

為獲得更多信息，將恒河猴肺和肝組織磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行激酶預(yù)測(cè)。在肺中，與炎癥（PKR、IKKβ、P38δ和JNK3）、細(xì)胞周期（CDK1和CDK2）、增殖（MAP2K1和MAP2K2）和代謝（AKT3、PKCi和AMPKs）相關(guān)的激酶被激活，而細(xì)胞骨架重組相關(guān)激酶MRCKα被抑制（圖5a）。在肝臟中，代謝相關(guān)的激酶（AMPKs和PKCs）被激活，而炎癥相關(guān)的激酶（JNK1和JNK2）則處于靜止甚至抑制狀態(tài)（圖5b）。在蛋白組和磷酸化蛋白組數(shù)據(jù)中并沒有發(fā)現(xiàn)所有的預(yù)測(cè)激酶（圖5c，d），說明激酶預(yù)測(cè)分析能擴(kuò)大SARS-CoV-2作用靶點(diǎn)的探索范圍。

圖5 恒河猴肺和肝中的激酶分析

6. 恒河猴SARS-CoV-2感染后肺、肝組織激酶與藥物整合分析

將DrugBank數(shù)據(jù)庫中的藥物與激酶預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行整合分析，發(fā)現(xiàn)11種FDA批準(zhǔn)的藥物可能對(duì)預(yù)測(cè)的激酶有效，其中福坦替尼（Fostamatinib）、米諾環(huán)素（minocycline）和他莫西芬（tamoxifen）在肺和肝臟中可能都起作用（圖6）。

圖6 藥物與恒河猴肺和肝中的激酶桑基圖

小結(jié)：

與人類的尸檢樣本相比，恒河猴模型能夠提供一個(gè)在感染早期研究組織分子變化的機(jī)會(huì)。研究人員首次對(duì)恒河猴SARS-CoV-2感染的肺和肝組織進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在受感染的肺和肝臟中，蛋白質(zhì)合成和加工均激活，ECM、細(xì)胞間連接和細(xì)胞骨架均失調(diào)，但肺和肝臟都沒有纖維化。并且發(fā)現(xiàn)，肺部在感染期間炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，而肝臟在感染期間氧化磷酸化和代謝過程增強(qiáng)。該研究為進(jìn)一步探索SARS-CoV-2的機(jī)制和藥物發(fā)現(xiàn)提供了有效的數(shù)據(jù)來源。

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