如何成為qPCR高手?
今天要講的是引物篇。

“擎科小講堂”上周推出了qPCR高手養(yǎng)成記第一期干貨文章：耗材篇。大家呼聲很高，紛紛“催更”。本周我們將推出第二篇干貨內(nèi)容：引物篇，圖文解析引物設(shè)計，助力實驗高效完成！

qPCR實驗中，引物設(shè)計是非常重要的一個環(huán)節(jié)，引物的合適與否與擴增效率是否達標、擴增產(chǎn)物是否特異、實驗結(jié)果是否可用等息息相關(guān)。

您是不是在qPCR引物設(shè)計中感到困惑：如何使引物特異性佳？有沒有什么一勞永逸的方法？
在設(shè)計qPCR引物時，通常要留意以下幾點：

• 引物盡量要跨內(nèi)含子設(shè)計

• 產(chǎn)物長度100-300 bp

• TM值盡量接近60℃且上下游引物盡量接近

• 引物末端是G或C
   

這么多的點要留意怎么辦？今天擎小科帶您一起五步搞定qPCR引物設(shè)計，讓qPCR引物設(shè)計成為你的絕殺技能。
 

第一步：查詢基因

通過NCBI查詢Homo GAS6的基因，這里要注意對比基因名稱、種屬，確保都要一致。

  1.若目標序列為基因組DNA，則選擇第一個，為該基因的基因組DNA序列。若目標序列為mRNA，則選擇第二個。
 

 

2.進入后，點擊如下表的“CDS”，棕色背景序列即為該基因的編碼序列。
 

 

1.進入Primer-BLAST界面。
 

2.在左上方輸入基因序列號或Fasta格式的序列，填寫好相關(guān)參數(shù)。
 

 

3.點擊“Get primers”NCBI就會彈出來告訴你，這樣的參數(shù)選擇會擴增到其他剪切變體，我們勾選不同的剪切變體并提交，就可以獲得合適的引物對了！（如下圖）
 

 

這些引物對的退火溫度，都在60℃左右。根據(jù)實驗?zāi)康模�選擇長度適中、特異性好和引物自身互補較少的引物進行實驗，成功率還是相當(dāng)高的呢！
 

第四步：引物特異性驗證

Primer-Blast除了可以設(shè)計引物外，還可以對我們自己設(shè)計的引物進行評價。返回引物設(shè)計的頁面，輸入我們設(shè)計好的上下游引物，其它參數(shù)不調(diào)整，提交后就可以看到這對引物是否在其它基因上也存在啦，如果全部都顯示在我們想要擴增的基因中，說明這對引物的特異性棒棒噠！(舉例引物查詢結(jié)果只此一條噢！）
 

  怎么樣的引物才是集“擴增效率達標”、“擴增產(chǎn)物特性好”、“實驗結(jié)果可靠”于一身呢，擎小科帶你領(lǐng)略一下。
 

 

引物的擴增效率達到90%-110%即認為擴增效率較好，熔解曲線單峰且通常Tm>80℃即認為擴增特異性較好。相當(dāng)簡單有木有啊～是不是感覺自己已經(jīng)告別科研小白的身份，瞬間掌握了qPCR引物設(shè)計的絕招啦。
 

如果您在引物設(shè)計中遇到問題，來擎科！
如果您想直接獲取可靠的引物序列，來擎科！

擎科生物基于多年qPCR檢測服務(wù)經(jīng)驗，對常見人源細胞信號通路相關(guān)基因進行了系統(tǒng)性的qPCR引物驗證，經(jīng)多次篩選驗證，可提供擴增效果好、特異性高的引物庫套裝，助您的實驗事半功倍。訂購5對引物即可贈送500 µL 2×qPCR Mix。

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