顯微成像技術(shù)在植物學(xué)研究中的應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：2575　發(fā)布日期：2022-8-3　來源：明美

一、植物學(xué)

植物在我們身邊無處不在，綠色植物光合作用產(chǎn)生的氧氣供養(yǎng)維系著人類的生存，人類的衣食住行也隨處可見植物的身影，從開始對植物形態(tài)上的簡單認識，隨著后來顯微工具和理論認識的發(fā)展，逐漸開始了植物解剖學(xué)、植物生理學(xué)、植物胚胎學(xué)、植物遺傳學(xué)等不同的研究，使人類對植物的認識更加深刻。

二、顯微成像技術(shù)在植物學(xué)研究中的應(yīng)用

（1）顯微鏡下的植物型態(tài)植物解剖

從解剖學(xué)特點去研究植物個體構(gòu)造、發(fā)育等特點，通常是借助體式顯微鏡或常規(guī)的生物顯微鏡，從比較宏觀（相對于細胞大小而言）的角度對活體植物或切片植物組織進行觀測，從而研究植物的器官、形態(tài)構(gòu)造和發(fā)育特點。

體視顯微鏡下的葉子

體式顯微鏡下的花房，黃色為花粉

花萼組織切片顯微觀察

花芽切片觀察

（2）顯微鏡下的植物生理

包括呼吸生理、光合生理等，如觀測樹葉的氣孔結(jié)構(gòu)去研究呼吸生理，氣孔是吸收外界CO₂并吐出O₂的重要通道，同時影響著光合作用和蒸騰作用，一般白天開，晚上閉。其開閉受保衛(wèi)細胞失水吸水控制，一般吸水后保衛(wèi)細胞膨脹彎曲，氣孔打開；失水后保衛(wèi)細胞重新伸直，氣孔關(guān)閉。

葉子的氣孔

此外，這一方向還包括對植物細胞的研究，觀察外界因素對植物細胞形態(tài)的影響等。

MF23+MSX2拍攝的明場狀態(tài)下的植物根須切片，可見植物細胞

（3）顯微鏡下的植物基因?qū)W

植物細胞有自發(fā)熒光現(xiàn)象，包括細胞壁纖維素和木質(zhì)素的淡綠色自發(fā)熒光（約540nm），以及葉綠體的藍色和紅色自發(fā)熒光（兩種激發(fā)波段）。

MF23+MSX2拍攝的熒光狀態(tài)下的植物根須切片（自發(fā)熒光）

目也可應(yīng)用外來的植物病毒表達載體（如GFP等），通過農(nóng)桿菌侵染植株，使植株細胞可以表達GFP，使用特定波長的激發(fā)光，可以觀察到相應(yīng)的熒光蛋白，此種方式可用于活體檢測，無需預(yù)處理，且植物本身不含此種綠色熒光，可避免假陽性。這種方式，可以應(yīng)用與篩選出高基因表達的植物，可提高農(nóng)作物產(chǎn)量、質(zhì)量，并不斷適應(yīng)人們對糧食的更高需求。

GFP熒光和自發(fā)熒光同時激發(fā)

在植物學(xué)研究中，有一類植物可稱為植物界中的“果蠅”，就是擬南芥，它是一種模式生物，具有發(fā)育快、個體小、可大量繁殖、結(jié)構(gòu)簡單、易于觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)和細胞、嚴格的閉花自花傳粉、穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點。擬南芥基因幫助水稻增產(chǎn)；有助于人類疾病的原理研究，擬南芥中生長素信號傳導(dǎo)途徑對認識人類某些疾病的發(fā)病機理提供幫助。它在糧食增產(chǎn)、農(nóng)作物耐逆、環(huán)境保護等域做出了重要貢獻。

在異源染色質(zhì)鑒定、染色體物理圖譜構(gòu)建、染色體RNA和基因組進化研究等域，還會使用FISH熒光原位雜交技術(shù)對植物基因進行標記，但相關(guān)技術(shù)和儀器要求較高，目還不算一種普遍的研究手段。

植物的FISH熒光原位雜交

三、顯微成像技術(shù)在植物學(xué)中的挑戰(zhàn)

（1）成像目標尺寸變化大

和模式生物研究類似，植物學(xué)研究很多時候會需要對植物宏觀型態(tài)和微觀型態(tài)進行成像，比如GFP標記在莖葉中的分布就需要比較低倍、宏觀的成像，需要用到體視熒光顯微鏡或類似解決方案，而細致到細胞層面則需要用到切片搭配生物顯微鏡，因此視乎需要，可能需要1臺或2臺顯微鏡。

（2）觀察植物熒光時減少自發(fā)熒光的干擾

在觀察植物等多細胞生物時，一般利用熒光蛋白選擇性地標示目標細胞或結(jié)構(gòu)，在植物熒光觀察中，若作為觀察目標的細胞或蛋白質(zhì)的信號微弱時，自身熒光會干擾識別，尤其在觀察植物細胞時，細胞壁、葉綠體等發(fā)出自身熒光的物質(zhì)是造成熒光模糊、重疊干擾的典型因素。使用合適的濾光片對于改善自發(fā)熒光干擾很有幫助，而且比較簡單容易實現(xiàn)，例如在植物細胞觀察中，可以使用帶通發(fā)射濾光片過濾細胞壁形成的黃色熒光，從而在抑制熒光模糊等自身熒光影響的情況下進行熒光觀察。

（3）活體觀察時紫外光對樣本和儀器的損傷

在觀察GFP熒光現(xiàn)象時，通常會使用紫外波段的光進行激發(fā)，但是這一波長的光長時間照射對細胞損傷較大，同時對顯微鏡的光學(xué)鍍膜也有一定的損傷，尤其對落射熒光的體視顯微鏡有巨大傷害。一種應(yīng)對思路是將紫外波段的激發(fā)光作為單獨的外置光源，可以進行獨立調(diào)節(jié)控制，避免高強度長時間的照射造成樣本和光學(xué)鍍膜損傷，另一種思路是使用紫色V波段取代紫外線作為激發(fā)光源。

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