Make it EVIDENT     

本期推出【SpinSR Makes Synapse Evident】

 

南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院/南京中醫(yī)藥大學(xué) 

孫凌云/胡剛團(tuán)隊(duì)

 

補(bǔ)體信號(hào)與神經(jīng)精神狼瘡

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種難以治愈的自身免疫性疾病，40-90% 的患者會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)精神癥狀，表現(xiàn)為焦慮、抑郁和認(rèn)知障礙等，稱為神經(jīng)精神狼瘡（NPSLE）。

既往觀念認(rèn)為NPSLE是系統(tǒng)性免疫持續(xù)激活累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的后果，然而，針對(duì)這些認(rèn)識(shí)的治療（免疫抑制劑及激素）并不能遏制病情進(jìn)展，長(zhǎng)期使用還易產(chǎn)生多種不良反應(yīng)。研究表明，神經(jīng)癥狀多出現(xiàn)在SLE病程早期，提示腦內(nèi)早發(fā)致病因素的存在。靶向這些因素的發(fā)現(xiàn)，是深化疾病認(rèn)知和治療學(xué)突破的關(guān)鍵。

補(bǔ)體蛋白C1q是經(jīng)典補(bǔ)體信號(hào)的啟動(dòng)因子。最近研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)C1q具有獨(dú)特的生物學(xué)功能，可以調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)突觸的修剪，對(duì)神經(jīng)環(huán)路的精準(zhǔn)發(fā)育及衰老、阿爾茨海默病、精神分裂癥等病變過(guò)程中的突觸丟失至關(guān)重要。但對(duì)于其在NPSLE中的效應(yīng)，仍然知之甚少。

神經(jīng)元-補(bǔ)體-小膠質(zhì)細(xì)胞突觸修剪調(diào)控神經(jīng)精神狼瘡

2022年2月18日，南京大學(xué)孫凌云教授與南京中醫(yī)藥大學(xué)胡剛教授團(tuán)隊(duì)合作，在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=38.104）上以長(zhǎng)文形式發(fā)表題為Neuronal NR4A1 deficiency drives complement-coordinated synaptic stripping by microglia in a mouse model of lupus的研究論文，提出神經(jīng)突觸丟失是NPSLE早期腦內(nèi)病理，其機(jī)理系通過(guò)神經(jīng)元Nr4a1-C1q-小膠質(zhì)細(xì)胞協(xié)同調(diào)控的突觸修剪。

 

研究團(tuán)隊(duì)首先利用自發(fā)狼瘡的MRL/lpr小鼠模型，利用綜合行為學(xué)分析系統(tǒng)進(jìn)行動(dòng)態(tài)評(píng)估，發(fā)現(xiàn)改模型小鼠在狼瘡病程早期（系統(tǒng)性病理改變及腎臟損傷之前）就已出現(xiàn)顯著的焦慮行為。同時(shí)模型小鼠海馬和皮層的小膠質(zhì)細(xì)胞激活。這一發(fā)現(xiàn)提示腦損傷發(fā)生在狼瘡病程的早期，腦內(nèi)小膠細(xì)胞激活可能參與狼瘡腦損傷的病理進(jìn)程。

 

MRL/lpr小鼠早期（6周齡）時(shí)出現(xiàn)焦慮行為（上圖）

伴海馬小膠質(zhì)細(xì)胞激活（下圖）

 

為了明確模型小鼠出現(xiàn)焦慮行為時(shí)腦內(nèi)病理改變的分子機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)小鼠海馬組織進(jìn)行RNA測(cè)序。作者發(fā)現(xiàn)，MRL/lpr小鼠海馬小膠質(zhì)吞噬基因激活，伴隨補(bǔ)體信號(hào)上調(diào)，同時(shí)神經(jīng)突觸傳遞、LTP信號(hào)被抑制。

 

MRL/lpr小鼠海馬屯膠質(zhì)吞噬信號(hào)、補(bǔ)體信號(hào)激活，突觸傳遞、LTP信號(hào)抑制

 

為了進(jìn)一步確定小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬激活、突觸功能異常在NPSLE中的作用，作者通過(guò)超分辨顯微成像，發(fā)現(xiàn)模型小鼠海馬突觸蛋白（SYN,突觸前膜; PSD-95,突觸后膜）熒光密度顯著減少。STED顯微鏡結(jié)合Imaris分析顯示，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬神經(jīng)突觸增多。進(jìn)一步利用藥理學(xué)方法抑制小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能，可以顯著緩解MRL/lpr小鼠海馬突觸丟失及焦慮行為。

 

MRL/lpr小鼠海馬突觸蛋白熒光信號(hào)顯著減少（上圖）

（使用Olympus SpinSR活細(xì)胞超分辨轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微成像系統(tǒng)拍攝）

 

為了進(jìn)一步明確C1q在小膠質(zhì)細(xì)胞突觸吞噬中的作用，研究團(tuán)隊(duì)首先通過(guò)顯微成像研究發(fā)現(xiàn)小鼠海馬升高的C1q多定位于突觸末端。作者進(jìn)一步利用中和抗體特異性阻斷小鼠海馬C1q信號(hào)，發(fā)現(xiàn)C1q阻斷可緩解狼瘡小鼠的神經(jīng)損傷。提示小膠質(zhì)細(xì)胞突觸修剪和C1q信號(hào)共同參與NPSLE的發(fā)病。

 

C1q主要定位于突觸末梢，利用中和抗體阻斷腦內(nèi)C1q信號(hào)可以緩解狼瘡小鼠的神經(jīng)損傷

 

除了小膠質(zhì)細(xì)胞修剪外，突觸結(jié)構(gòu)或神經(jīng)元內(nèi)在電活性的改變也參與突觸密度的調(diào)節(jié)。但對(duì)于神經(jīng)元如何與小膠質(zhì)細(xì)胞溝通并協(xié)同調(diào)控突觸丟失，仍然知之甚少。

 

接下來(lái)，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)突觸修剪的神經(jīng)元調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了探究。通過(guò)對(duì)MRL/Lpr小鼠海馬組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出了潛在效應(yīng)信號(hào)分子-Nr4a1。

 

有趣的是，抑制神經(jīng)元的興奮性可以減少Nr4a1的表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道的降低的神經(jīng)元電活性促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞突觸修剪的理論一致，支持Nr4a1參與狼瘡腦內(nèi)突觸吞噬的作用。為了確認(rèn)Nr4a1的具體調(diào)控機(jī)制，團(tuán)隊(duì)制備了神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型，并利用敲減慢病毒在原代神經(jīng)元中干擾Nr4a1表達(dá)，明確神經(jīng)元Nr4a1信號(hào)減弱導(dǎo)致突觸骨架蛋白異常，作為橋梁信號(hào)促進(jìn)C1q的突觸定位，并被活化的小膠質(zhì)細(xì)胞識(shí)別吞噬。

 

在原代神經(jīng)元中敲減Nr4a1科減少C1q的突觸定位

 

下一步，團(tuán)隊(duì)對(duì)Nr4a1調(diào)控狼瘡腦損傷的體內(nèi)作用進(jìn)行了探究。團(tuán)隊(duì)利用先前確定的海馬立體定位注射技術(shù)和過(guò)表達(dá)慢病毒，在模型小鼠海馬神經(jīng)元中過(guò)表達(dá)Nr4a1。

 

利用這一方法，團(tuán)隊(duì)證明了海馬神經(jīng)元Nr4a1是調(diào)控C1q定位及小膠質(zhì)細(xì)胞定向突觸修剪介導(dǎo)NPSLE發(fā)病的關(guān)鍵信號(hào)。

 

海馬神經(jīng)元特異性過(guò)表達(dá)Nr4a1緩解狼瘡腦損傷

（突觸熒光信號(hào)圖 使用Olympus SpinSR活細(xì)胞超分辨轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微成像系統(tǒng)拍攝）

 

因此，該研究應(yīng)用多種模型及研究方法，闡明了突觸丟失是狼瘡腦損傷的早期病理，小膠質(zhì)細(xì)胞、補(bǔ)體信號(hào)、神經(jīng)元共同參與該過(guò)程。

 

同時(shí)，該工作首次揭示神經(jīng)元內(nèi)在Nr4a1異常在調(diào)控C1q-小膠質(zhì)細(xì)胞“突觸修剪”中的主動(dòng)作用。為狼瘡腦損傷及相關(guān)疾病的早期干預(yù)提供了新策略及新靶點(diǎn)。

 

Nr4a1-C1q-microglia 調(diào)控突觸修剪參與NPSLE發(fā)病機(jī)制的示意圖

 

在本次研究中，小鼠海馬突觸蛋白熒光標(biāo)記圖片使用了Olympus SpinSR活細(xì)胞超分辨轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微成像系統(tǒng)拍攝，該系統(tǒng)無(wú)需特殊標(biāo)記手段即可實(shí)現(xiàn)低至110nm的XY分辨率，成像速度可達(dá)200pfs，適合進(jìn)行快速圖像拼接及低光毒性延時(shí)成像，更有利于在較大的范圍內(nèi)觀察標(biāo)本或者對(duì)活體樣品進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間觀察。在此，感謝Evident江蘇省代理商 南京奧力科學(xué)儀器有限公司市場(chǎng)部 毛雨 對(duì)實(shí)驗(yàn)的大力支持。