哺乳動物大腦發(fā)育過程極其復雜，包括形態(tài)發(fā)生、細胞間相互作用和內(nèi)在的遺傳程序，最終形成不同的細胞類型。單細胞轉(zhuǎn)錄組和空間組學解析組織細胞異質(zhì)性的能力，特別適合在大腦發(fā)育的整個過程中對細胞狀態(tài)進行系統(tǒng)地研究。來自瑞典的研究人員在Nature上發(fā)表題為“Molecular architecture of the developing mouse brain”的文章。該文章系統(tǒng)性地描繪了小鼠胚胎從原腸胚形成到分娩之間大腦發(fā)育的完整單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，確定了近800種細胞類型，并且描述了這些細胞的發(fā)育過程。結合原位雜交技術繪制了關鍵發(fā)育基因的空間表達圖譜，揭示了神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中神經(jīng)祖細胞的準確空間位置。  
研究材料

選擇了小鼠胚胎第7至第18天（E7-E18）不同部位，共93個樣本

技術路線

步驟1：取E7-E16的93個樣本進行單細胞檢測，并構建了細胞圖譜；

步驟2：對神經(jīng)元類細胞進行亞群再分析；

步驟3：對非神經(jīng)元類細胞進行亞群再分析;

步驟4：通過ISS檢測對單細胞數(shù)據(jù)進行空間定位驗證。

 研究結果
 

1. 通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術，構建小鼠大腦的細胞圖譜

通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序檢測，共獲得了292,495個細胞用于單細胞數(shù)據(jù)分析，通過對這些細胞進行細胞類型注釋，共鑒定到了798種細胞類型，作者根據(jù)腦細胞的主要類別（成纖維細胞、血管、免疫、放射狀膠質(zhì)細胞、膠質(zhì)母細胞、神經(jīng)母細胞和神經(jīng)元）、胚胎發(fā)育時間、細胞標志物和取樣的空間位置，對細胞類型進行了全面的注釋。tSNE圖顯示細胞主要按胎齡分布。在E7時，細胞分離成原腸胚形成過程中產(chǎn)生的三個胚層。神經(jīng)嵴在E8-E10期間形成，并在E10-E16期間分化為形成腦膜的成纖維細胞譜系。早期的神經(jīng)管在E8形成，然后分化成為放射狀膠質(zhì)細胞。兩大類神經(jīng)元從神經(jīng)管分支出來，一類包含前腦興奮性神經(jīng)元，另一類包含其他所有神經(jīng)元類型。同時，作者發(fā)現(xiàn)大約在E14之后，放射狀膠質(zhì)細胞逐漸失去增殖能力并轉(zhuǎn)變?yōu)槟z質(zhì)母細胞狀態(tài)，最終演化成為星形膠質(zhì)細胞、室管膜細胞和少突膠質(zhì)細胞前體 (OPC) 細胞。
 

圖1 發(fā)育中的小鼠大腦圖譜

2. 對神經(jīng)元類細胞進行亞群再分析

隨后作者對E7-E8.5時期的細胞群進行了分群分析，這一時期主要是原腸胚晚期和神經(jīng)形成早期的細胞。并根據(jù)細胞亞群聚類分析，將細胞群分為五個類群。包括原條階段細胞、非神經(jīng)譜系限定細胞和早期神經(jīng)上皮祖細胞。進一步對神經(jīng)上皮細胞群分析，共鑒定出了十個亞群，并且發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)胚形成過程中,Secondary organizers的特殊神經(jīng)前體細胞調(diào)控了大腦的形態(tài)發(fā)生。此外E9-E11放射狀膠質(zhì)細胞群中的Secondary organizers亞型中差異表達大量轉(zhuǎn)錄因子、分泌配體和表面受體相關基因。這些organizers分泌的形態(tài)發(fā)生素可能在特定區(qū)域，誘導局部神經(jīng)元的分化。
 

圖2.1 神經(jīng)形成過程中的細胞類型異質(zhì)性

圖2.2 神經(jīng)管的分子多樣性

 

3.  對非神經(jīng)元類細胞進行亞群再分析

接下來，作者對膠質(zhì)細胞及相關祖細胞進行了亞群再聚類分析，主要包括表達神經(jīng)源性標記物的細胞和表達神經(jīng)膠質(zhì)標記物的細胞。結果發(fā)現(xiàn)非端腦膠質(zhì)母細胞和寡突細胞前體細胞，以及與端腦膠質(zhì)母細胞的異質(zhì)性。顯示了這一區(qū)域的特異性，同時進一步證明了E12到E16之間發(fā)生了神經(jīng)元到膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)變。而最早的星形膠質(zhì)細胞出現(xiàn)在大約E15時期。同時巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞從胚外卵黃囊發(fā)育，并在E9.5進入大腦，并且取代原本存在早期巨噬細胞。

圖3 非神經(jīng)元類細胞發(fā)育特征

 

4. 通過ISS檢測對單細胞數(shù)據(jù)進行空間定位驗證

發(fā)育中的大腦不同空間域包含各種轉(zhuǎn)錄特征轉(zhuǎn)錄因子。隨著時間的推移，這些區(qū)域通過一些相互作用而逐漸分化。為了將這一復雜過程與轉(zhuǎn)錄細胞狀態(tài)聯(lián)系起來，作者對在E10.5小鼠胚胎的24個矢狀切面上對119個基因進行了原位雜交獲得空間表達信息，并將單細胞結果和空間結構進行對應，從而對不同的細胞類型確定準確的空間位置。

圖4 細胞類型和狀態(tài)的空間分布

 

 小編小結

本文通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，對大腦發(fā)育不同階段的細胞類型進行了系統(tǒng)性的分析，并結合時間和空間信息分析了不同細胞的分化起源，展示了小鼠胚胎時期大腦轉(zhuǎn)錄組的多樣性，這是對哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)展進行研究的關鍵步驟。另外，該圖譜中所提供的發(fā)育時間、細胞譜系以及區(qū)域特異性的基因表達為遺傳靶點的研究提供了關鍵工具，也為理解神經(jīng)發(fā)育相關的疾病例如腦癌提供了重要平臺。