培養(yǎng)細(xì)胞純化的兩大方法
 

體外培養(yǎng)細(xì)胞源于動(dòng)物機(jī)體，而機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞都混雜生長，每一種組織都有血管和間葉組織，因此，從體內(nèi)取得的培養(yǎng)材料所做的原代培養(yǎng)，絕大多數(shù)都是各種細(xì)胞混合生長。其主要表現(xiàn)為兩大類,即上皮樣細(xì)胞和纖維樣細(xì)胞。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中即使都是纖維樣細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞，它們也有種類的不同，如纖維樣細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等。而利用體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究都要求采用單一種類細(xì)胞，這樣才能對(duì)某一細(xì)胞的功能、形態(tài)等的變化進(jìn)行研究，因此培養(yǎng)細(xì)胞的純化就成為體外培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究的重要一步。

 

細(xì)胞的純化一般分為自然純化和人工純化兩大類�？筛鶕�(jù)不同細(xì)胞種類、來源、實(shí)驗(yàn)要求和目的而選擇不同的純化方法。下面主要介紹一些基本的方法。

自然純化
 

自然純化即利用某一種類細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)，排擠其他細(xì)胞生長，靠自然的增殖潛力最后留下生長優(yōu)勢(shì)細(xì)胞，去除其他細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的。但這種方法常無法人為的選擇細(xì)胞，時(shí)間長，多數(shù)情況下，剩下的都是成纖維細(xì)胞，因此，僅有些惡性腫瘤細(xì)胞可以通過此方法，自然純化而建立細(xì)胞系。

 

人工純化
 

利用人為手段造成對(duì)某一細(xì)胞生長有利的環(huán)境條件，抑制其他細(xì)胞的生長，從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的。
 

1.酶消化法

①概述：由于上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同，成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶比較敏感，而上皮細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性較高，因此，在消化培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，成纖維細(xì)胞先脫壁，而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長的時(shí)間才脫壁，特別是原代培養(yǎng)和培養(yǎng)早期,這種差異尤為明顯，因而可以利用這種差異采用多次差別消化方法，將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開達(dá)到純化細(xì)胞的目的。

②方法：采用普通消化傳代方法，將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶內(nèi)兩次，每次加1 mL(25 mL培養(yǎng)瓶)，稍加搖動(dòng)讓胰蛋白酶流過所有細(xì)胞表面，然后倒掉。蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)纖維樣細(xì)胞變圓，部分脫壁，立即加入2mL有血清培養(yǎng)液，終止消化。用彎頭吸管輕輕吹打纖維樣細(xì)胞生長的區(qū)域(可事先在顯微鏡下用記號(hào)筆在培養(yǎng)瓶上畫出記號(hào))。吹打過程中不要用力，也不要吹上皮細(xì)胞生長區(qū)域。吹打結(jié)束后，再用少量培養(yǎng)液漂洗一遍，然后加入適量培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，也可重復(fù)上述操作再進(jìn)行一次，或隔幾日后或下次傳代時(shí)，再進(jìn)行上述操作。經(jīng)過幾次處理可以將成纖維細(xì)胞去除或?qū)�兩者分開。
 

2.機(jī)械劃除法

(1)概述：原代培養(yǎng)成功后，上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞多數(shù)都同時(shí)出現(xiàn)，混雜生長。這種混雜生長常常分區(qū)呈片，每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長在瓶壁上。因此可以采用機(jī)械的方法去除不需要的細(xì)胞的區(qū)域，而保留需要的。
(2)方法：將要純化細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，放在倒置顯微鏡監(jiān)視下進(jìn)行。用彎頭滴管在不需要生長的細(xì)胞區(qū)域推劃，使細(xì)胞脫壁懸浮在培養(yǎng)液中，注意不要傷及所需細(xì)胞;推劃后用培養(yǎng)液沖洗兩次，即可加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng);數(shù)日后如發(fā)現(xiàn)不需要的細(xì)胞又長出，可再進(jìn)行上述操作，這樣反復(fù)多次可以純化細(xì)胞。操作過程要嚴(yán)格無菌操作，防止污染。
 

3.反復(fù)貼壁法

(1)概述：成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞相比，其貼壁過程快，大部分細(xì)胞常能在10~30 min完成附著過程(但不一定完全伸展);而上皮細(xì)胞大部分在短時(shí)間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起。利用不同細(xì)胞貼壁速度不同的特點(diǎn)，經(jīng)過反復(fù)貼壁，可以將早期傳代培養(yǎng)中的成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞分開。

(2)方法：將細(xì)胞懸液接種到一個(gè)培養(yǎng)瓶內(nèi)(最好用無血清培養(yǎng)，因?yàn)樵跓o血清支持下，上皮細(xì)胞貼壁更慢)靜置20 min;在顯微鏡下觀察，見細(xì)胞部分貼壁，稍加搖蕩也不浮起時(shí)，將培養(yǎng)液連同尚未貼壁細(xì)胞一起倒出或吸到另一培養(yǎng)瓶;繼續(xù)培養(yǎng)或重復(fù)上述操作，將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞逐步分隔開。
 

4.克隆法

在同一細(xì)胞系中，存在不同的細(xì)胞株，它們的功能和生長特點(diǎn)僅略有不同，要純化出某一種細(xì)胞，用上述方法常不能將同一細(xì)胞系的不同株分開，可采用細(xì)胞克隆的方法。

具體過程是采用細(xì)胞克隆法將細(xì)胞分成單個(gè)細(xì)胞，使之分別生長成克隆，然后對(duì)每一克隆進(jìn)行測(cè)試，選擇出所需要的克隆。

 

5.培養(yǎng)基限定方法

某些細(xì)胞在生長過程中必須存在或去除某種物質(zhì)，否則將無法生長，而其他細(xì)胞與之相反�？梢岳�用這種技術(shù)來純化細(xì)胞。如雜交瘤技術(shù)中常用的HAT培養(yǎng)液，就用來篩選雜交瘤細(xì)胞而抑制其他細(xì)胞。

 

6.流式細(xì)胞儀分離法

流式細(xì)胞儀可根據(jù)細(xì)胞核酸含量、某些物質(zhì)含量或細(xì)胞結(jié)構(gòu)大小等參數(shù)來將細(xì)胞分離成不同的群體。

 

推 薦 產(chǎn) 品

 

【SNT-002】0.25%胰酶（含EDTA）

【SNB-001】PBS磷酸鹽緩沖液

【SNP-M167】小鼠臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞

 

公 司 簡 介
 

武漢尚恩生物技術(shù)有限公司坐落于武漢東湖高新區(qū)光谷生物城，專注于細(xì)胞及系列產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和服務(wù)，公司建有標(biāo)準(zhǔn)化GMP實(shí)驗(yàn)室、動(dòng)物房，已整體通過ISO 9001:2015質(zhì)量管理體系認(rèn)證，獲得高新技術(shù)企業(yè)、3551人才、瞪羚企業(yè)、科技小巨人等多項(xiàng)榮譽(yù)�！　�

 

公司主要研發(fā)生產(chǎn)細(xì)胞系、原代細(xì)胞、胎牛血清、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、輔助試劑等系列產(chǎn)品，提供細(xì)胞及培養(yǎng)配套產(chǎn)品一站式采購；細(xì)胞庫凍存細(xì)胞系500余種，同時(shí)通過不間斷引種細(xì)胞擴(kuò)大豐富細(xì)胞種類；公司還提供人源細(xì)胞系的STR鑒定、大小鼠的種屬鑒定服務(wù)等�！　�

 

公司細(xì)胞業(yè)務(wù)覆蓋國內(nèi)各大高校生物實(shí)驗(yàn)室、生物研究機(jī)構(gòu)及一些生物科研、診斷、制藥公司，不斷為廣大科研工作者提供最優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和服務(wù)！尚恩生物—您專業(yè)的細(xì)胞供應(yīng)商！