Abstract

新型病毒對(duì)人類健康構(gòu)成了不容小覷的嚴(yán)重威脅，它們引起的感染往往會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病，甚至死亡，因?yàn)槿祟惷庖呦到y(tǒng)尚無力對(duì)抗一種陌生的病毒，特別是人畜共患的病毒。最近的疫情也表明了新型病毒的危險(xiǎn)性。假型病毒可用于輕松研究此類病毒的進(jìn)入路徑。
 
 
簡介

由于種間傳播或病毒基因組的自然變化，新型病毒已具備對(duì)人類造成感染的能力，各種因素都會(huì)促進(jìn)新型病毒的發(fā)生和傳播。在過去100年里，發(fā)生了多次新型病毒感染人類的情況，導(dǎo)致了局部出現(xiàn)疫情或全球傳播（大流行；見表1）。
 
 
對(duì)于新型病毒的研究目前一般局限于生物安全級(jí)別（BSL）達(dá)到 3 級(jí)或 4 級(jí)的高安全性實(shí)驗(yàn)室（見表1）。BSL-4實(shí)驗(yàn)室的工作非常費(fèi)力且成本昂貴，而且僅可在少數(shù)幾個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行，因此很難在表征病毒病原體和開發(fā)抗病毒藥物方面取得快速的科學(xué)進(jìn)展。

在這種情況下，假型病毒為安全有效地研究高致病性病毒進(jìn)入細(xì)胞提供了一個(gè)有效的選擇。假型的常用系統(tǒng)基于彈狀病毒（例如，水泡性口炎病毒、VSV；圖1）和逆轉(zhuǎn)錄病毒。

本項(xiàng)研究的目的是驗(yàn)證包膜蛋白介導(dǎo)的假型病毒進(jìn)入是否反映了完整病毒的宿主細(xì)胞進(jìn)入，以及確定所用試劑（在本例中為實(shí)驗(yàn)室用水）的純度水平對(duì)假型病毒產(chǎn)生的影響。
  

圖1：假型VSV的制備： 1）VSV G反式互補(bǔ)VSV進(jìn)入表達(dá)包膜蛋白的細(xì)胞。 2）中和過量病毒。 3）將待研究的包膜蛋白包埋在假型VSV的膜中，收獲假型VSV。

 
 
材料和方法

采用含 10 %胎牛血清和 1 %青霉素/鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基在 37 °C和 5 % CO2下培養(yǎng)HEK-293T、MDCKII和Vero E6細(xì)胞。傳代和接種時(shí)，細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，用胰蛋白酶/EDTA消化分離。

將VSV糖蛋白(VSV G)、埃博拉病毒糖蛋白(EBOV GP)、中東呼吸綜合征冠狀病毒S糖蛋白(MERS-CoV S) 、H1N1(1918)的甲型流感病毒的血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA) 病毒包膜蛋白的質(zhì)粒用作表達(dá)載體。

此外，使用二肽基肽酶4(DPP4)的表達(dá)質(zhì)粒�？瞻妆磉_(dá)質(zhì)粒作為對(duì)照。使用鈣|磷酸鹽沉淀轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，其中所有緩沖液和溶液均使用去離子水或賽多利斯Arium® Pro VF超純水制備。
  
超純水的制備
使用Arium® Pro VF制備的超純水，水的TOC含量降至 2 ppb，電導(dǎo)率為 0.055 μS/cm(18.2MΩ×cm的電阻率)，補(bǔ)償至25°C。
 
假型VSV的制備
使用復(fù)制缺陷型VSV載體制備假型VSV，其中VSV糖蛋白（VSV G）的基因組信息被兩個(gè)報(bào)告基因替代，且 VSV G必須以反式提供。

用唾液酸酶或抑制劑預(yù)處理靶細(xì)胞
用 200 mU重組唾液酸酶處理MDCKII細(xì)胞，以從質(zhì)膜的糖蛋白和糖脂中去除末端唾液酸。
 
分析包膜蛋白介導(dǎo)的宿主細(xì)胞進(jìn)入
將靶細(xì)胞和假型VSV培養(yǎng) 1 小時(shí)，然后用PBS洗滌，并進(jìn)一步用細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng) 16 – 20 小時(shí)。之后，使用螢光素酶裂解緩沖液裂解細(xì)胞，并且使用市售的測定試劑盒在化學(xué)發(fā)光儀中測量細(xì)胞裂解物中螢光素酶活性，以評(píng)估由包膜蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。
 
 
結(jié)果
 
如果假型的包膜中嵌入了MERS-CoV S，則DPP4的定向表達(dá)使假型VSV進(jìn)入宿主細(xì)胞顯著增加（見圖2A）。

唾液酸的去除導(dǎo)致假型VSV進(jìn)入宿主細(xì)胞顯著減少，該假型VSV有H1N1(1918)HA/NA嵌入其包膜中（見圖2B）。這一發(fā)現(xiàn)證實(shí)假型病毒反映了真正的甲型流感病毒進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制。
  圖2. 假型病毒受體依賴性進(jìn)入細(xì)胞：
（A）將具有VSV G或MERS-CoV S的假型VSV用于接種之前已經(jīng)用空載體（無受體）或人二肽基肽酶4(DPP4)的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK-293T細(xì)胞。（B）用具有VSV G或H1N1 (1918) HA/NA包膜蛋白的假型VSV接種經(jīng)唾液酸酶預(yù)處理或未經(jīng)處理的MDCKII細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，即進(jìn)入效率，由病毒編碼的螢光素酶的活性確定并標(biāo)準(zhǔn)化。此外，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)顯著性通過t檢驗(yàn)得到確認(rèn)(*:p<0.05)。
 
埃博拉病毒糖蛋白在細(xì)胞進(jìn)入過程中的激活具有pH依賴性并且需要半胱氨酸蛋白酶活性。在假型VSV背景下的EBOV GP介導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)入還取決于酸性環(huán)境（見圖3A）和半胱氨酸蛋白酶的活性（見圖3B）。
  圖3：假型病毒pH依賴性進(jìn)入細(xì)胞：
帶VSV G或EBOV GP的假型VSV用于接種預(yù)先用巴佛洛霉素A1(A)或E-64d(B)處理的Vero E6細(xì)胞（未處理的細(xì)胞用作對(duì)照）。通過病毒編碼的螢光素酶的活性確定假型病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，即進(jìn)入效率，并將所得數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。此外，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義通過t檢驗(yàn)得到確認(rèn)(*:p<0.05)。

實(shí)驗(yàn)室用水的水質(zhì)影響假型VSV的質(zhì)量：

在平行實(shí)驗(yàn)中生成兩批假型VSV：一批使用中心實(shí)驗(yàn)室供水源的去離子水（19 °C時(shí)電導(dǎo)率為 3.7 – 4.1 μS/cm）作為所有溶液和緩沖液的基本溶劑；另一批使用基于Arium® Pro VF超純水的溶液和緩沖液（電導(dǎo)率為0.055 μS/cm，補(bǔ)償至 25 °C）來制備。檢測了作為包膜蛋白的EBOV GP和MERS-CoV S。通過保持相同的孵育條件平行生產(chǎn)假型VSV，接種靶細(xì)胞，并量化包膜蛋白介導(dǎo)的假型VSV進(jìn)入。

實(shí)驗(yàn)表明，使用Arium® Pro VF超純水作為所有緩沖液和溶液的基本溶劑生產(chǎn)的假型VSV的宿主進(jìn)入(作為質(zhì)量程度的參數(shù))顯著高于使用去離子水的假型的宿主進(jìn)入(圖4)。
  圖4：實(shí)驗(yàn)室用水的純度水平影響假型病毒的質(zhì)量：
具有EBOV GP或MERS-CoVS的假型VSV用基于去離子水(顯示在“去離子水”狀態(tài)下)和Arium® Pro VF超純水(顯示在“超純水”狀態(tài)下)的緩沖液和溶液制備，并用于接種Vero E6細(xì)胞。通過定量病毒編碼的螢光素酶來確定假型病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，即進(jìn)入效率，并將所得數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。此外，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義通過t檢驗(yàn)得到確認(rèn)(*:p<0.05)。
 
 
討論

本研究以復(fù)制缺陷型水皰性口炎病毒(VSV)為基礎(chǔ)產(chǎn)生假型病毒，并對(duì)各種高致病性病毒的包膜蛋白進(jìn)行了研究。我們發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞進(jìn)入依賴于如真實(shí)病毒所描述的相同受體分子和生化過程。此外，我們還證明使用超純水生產(chǎn)假型VSV可以優(yōu)化這一過程。

假型病毒是研究高致病性病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的重要工具，不需要將這種高致病性病毒的研究限制于BLS-3或BLS-4實(shí)驗(yàn)室。假型病毒的使用還降低了勞動(dòng)強(qiáng)度、成本和其它諸多限制性因素，并顯著提高了操作的安全性。
 
 
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下載本篇《利用假型病毒對(duì)高致病性病毒進(jìn)行研究》應(yīng)用說明了解超純水質(zhì)量在這種假型病毒制備中的重要性。