樹突狀細(xì)胞（DCs）是主要的抗原呈遞細(xì)胞，在自身免疫性葡萄膜炎中發(fā)揮重要作用。新的證據(jù)表明，膽汁酸（BAs）調(diào)節(jié)DCs的成熟。然而，BAs調(diào)節(jié)DCs功能的潛在機(jī)制仍需進(jìn)一步確定。
 

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院李鴻教授團(tuán)隊(duì)等人于7月11日在農(nóng)業(yè)與生物科學(xué)領(lǐng)域頂級(jí)期刊International Journal of Biological Sciences（IF 10.75）發(fā)表題為“Lithocholic acid inhibits dendritic cell activation by reducing intracellular glutathione via TGR5 signaling”的研究文章，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（中科新生命提供服務(wù)）、qPCR、ELISA和Western blot等技術(shù)對(duì)BAs調(diào)節(jié)DCs的功能機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)石膽酸（LCA）能通過(guò)激活TGR5信號(hào)來(lái)抑制DCs中谷胱甘肽（GSH）的產(chǎn)生并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，下調(diào)NF-κB和MAPK途徑，從而抑制骨髓源性DCs（BMDCs）促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生并可導(dǎo)致DCs的凋亡和自噬。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)LCA和TGR5激動(dòng)劑可能是治療自身免疫性葡萄膜炎的潛在藥物。

 

 研究材料

TGR5^+/+和TGR5^-/-小鼠來(lái)源的BMDCs和視網(wǎng)膜組織、健康人和免疫性葡萄膜炎患者來(lái)源的MD-DCs

 

 技術(shù)路線

步驟1：LPS誘導(dǎo)并補(bǔ)充LCA后，BMDCs促炎細(xì)胞因子分泌水平、表面標(biāo)志物和膽汁酸受體表達(dá)水平的檢測(cè)；

步驟2：siRNA抑制TGR5和FXR表達(dá)后，BMDCs促炎細(xì)胞因子分泌水平、表面標(biāo)志物表達(dá)水平的檢測(cè)；

步驟3：補(bǔ)充LCA后，自身免疫性結(jié)膜炎小鼠模型（EAU）病理特征、免疫細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子水平檢測(cè)；

步驟4：使用人源MD-DCs進(jìn)行步驟1-3實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證；

步驟5：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)LCA處理后TGR5^+/+ vs TGR5^-/- BDMCs基因表達(dá)和功能富集差異；

步驟6：LCA和TGR5激動(dòng)劑處理后，TGR5^+/+ vs TGR5^-/- BDMCs表型和分子特征檢測(cè)。

 

 研究結(jié)果
 

1. BAs可抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和DCs表面標(biāo)志物的表達(dá)

LPS誘導(dǎo)BMDCs后，補(bǔ)充BAs能抑制幾種促炎細(xì)胞因子的分泌，并抑制BMDCs表面標(biāo)記物CD40、CD86、CD80和MHCII的表達(dá)，其中LCA效果最為顯著（圖1）。

 

2. LCA通過(guò)TGR5信號(hào)抑制DCs促炎細(xì)胞因子分泌，減輕小鼠EAU的嚴(yán)重程度

QPCR結(jié)果表明，LCA誘導(dǎo)BMDCs中FXR和TGR5的mRNA表達(dá)，INT-777、747（TGR5特異性激動(dòng)劑）顯著抑制BMDCs中促炎細(xì)胞因子的分泌（圖2 A、B）。使用siRNA抑制BMDCs中TGR5、FXR的表達(dá)，結(jié)果表明抑制TGR5表達(dá)能更大程度上逆轉(zhuǎn)LCA對(duì)細(xì)胞因子分泌的抑制作用，并在TGR5^-/- BMDC的體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果（圖2 C-G）。以上結(jié)果表明，LCA通過(guò)TGR5信號(hào)調(diào)節(jié)DCs的功能。

圖2 LCA通過(guò)TGR5信號(hào)通路抑制DCs中促炎細(xì)胞因子的分泌

此外，TGR5^+/+小鼠補(bǔ)充LCA可抑制小鼠病理表現(xiàn)、保護(hù)小鼠視網(wǎng)膜血管完整性、顯著改善EAU的嚴(yán)重程度并減緩其進(jìn)展，TGR5^-/-小鼠中這種效果則發(fā)生逆轉(zhuǎn)（圖3）。

圖3 LCA通過(guò)TGR5信號(hào)通路減輕小鼠EAU的嚴(yán)重程度

 

3. LCA通過(guò)TGR5信號(hào)通路抑制DCs的抗原呈遞功能及MD-DCs的激活

體外實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)充LCA的TGR5^+/+ EAU小鼠中分離的CD11c⁺ DCs顯著抑制Th17、Th1細(xì)胞的分化以及IFN-γ和IL-17的分泌，而這種現(xiàn)象在TGR5^-/-組中發(fā)生逆轉(zhuǎn)（圖4 A-C）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（小鼠脾臟和視網(wǎng)膜組織）觀察到類似的結(jié)果（圖D-E）。

圖4 LCA通過(guò)TGR5信號(hào)通路抑制DCs的抗原呈遞功能

人源MD-DCs細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果（圖5）。

圖5 LCA通過(guò)TGR5信號(hào)抑制MD-DCs的激活

 

4. TGR5信號(hào)通過(guò)抑制GSH的產(chǎn)生和誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)抑制DCs產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子

對(duì)LPS誘導(dǎo)并補(bǔ)充LCA處理后的TGR5^+/+ vs TGR5^-/- BDMCs進(jìn)行RNA-Seq，共檢出1584個(gè)DEGs（其中上調(diào)641個(gè)，下調(diào)943個(gè)）。KEGG pathway富集分析顯示TGR5^+/+組中24條途徑上調(diào)（如核糖體表達(dá)、GSH代謝途徑等），12條途徑下調(diào)（如磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、HIF-1信號(hào)通路等）（圖6）。

圖6 TGR5信號(hào)通路調(diào)節(jié)DCs內(nèi)GSH代謝

通常GSH缺乏會(huì)抑制DCs成熟和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，體外實(shí)驗(yàn)表明補(bǔ)充LCA和INT-777、747可顯著抑制TGR5^+/+組細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性（包括GSH過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶等），誘導(dǎo)ROS積累，而TGR5敲除則會(huì)逆轉(zhuǎn)這些結(jié)果（圖7 A-D）。使用GSH還原型乙酯（GSH OEt）增加TGR5^+/+ BMDCs中GSH的表達(dá)后，促炎細(xì)胞因子分泌水平增加（圖7 E）。

圖7 TGR5的激活通過(guò)抑制GSH的產(chǎn)生、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激來(lái)抑制DCs中促炎細(xì)胞因子的分泌

 

5. LCA通過(guò)TGR5信號(hào)通路促進(jìn)DCs凋亡和自噬

相較于TGR5^-/-，補(bǔ)充LCA增加了TGR5^+/+ BMDCs中膜聯(lián)蛋白+7AAD細(xì)胞的比例，并增加與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和C-caspase3的表達(dá)，降低BCL-2的表達(dá)（圖8 A-C）。此外，LCA增加了參與自噬的2種蛋白LC3II/LC3I比率和Beclin1的表達(dá)（圖8D）。這些結(jié)果表明LCA可促進(jìn)BMDCs凋亡和自噬。

圖8 LCA通過(guò)TGR5信號(hào)通路促進(jìn)DCs的凋亡和自噬

 小編小結(jié)

本研究表明，BAs抑制DCs中促炎細(xì)胞因子和表面標(biāo)志物的表達(dá)，LCA效果最為突出，其中TGR5是LCA最有效的下游靶點(diǎn)。LCA通過(guò)TGR5信號(hào)抑制DCs激活，通過(guò)減少GSH產(chǎn)生，下調(diào)NF-κB和MAPK途徑從而降低促炎細(xì)胞因子分泌，并促進(jìn)DCs凋亡和自噬，以調(diào)節(jié)自身免疫性葡萄膜炎的發(fā)展。此外，本文研究結(jié)果表明，LCA和TGR5激動(dòng)劑是治療自身免疫性疾病和炎癥性疾�。ò�括自身免疫性葡萄膜炎）的潛在治療藥物。