鎘（Cd）污染對(duì)作物生長(zhǎng)發(fā)育、食品安全和人類健康造成嚴(yán)重威脅，并成為潛在的農(nóng)業(yè)和全球環(huán)境問題。鋅（Zn）被用于減少土壤和植物中Cd的積累。位于質(zhì)膜（PM）上的蛋白質(zhì)在植物逆境信號(hào)傳遞中起著重要作用。隨著植物對(duì)重金屬的吸收、運(yùn)輸和耐受機(jī)制研究的深入，脅迫相關(guān)PM蛋白的研究意義日益凸顯。
 

2022年5月，中國水稻研究所林曉燕老師團(tuán)隊(duì)在Journal of Hazardous Materials （IF 14.224）上發(fā)表題為“The potential role of plasma membrane proteins in response to Zn stress in rice roots based on iTRAQ and PRM under low Cd condition”的研究文章。該研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)和PRM靶向組學(xué)技術(shù)分析了低鎘條件下水稻根系質(zhì)膜蛋白對(duì)鋅脅迫響應(yīng)的差異變化，以及差異表達(dá)蛋白參與鋅-鎘轉(zhuǎn)運(yùn)的響應(yīng)機(jī)制，為進(jìn)一步研究水稻耐重金屬脅迫、生長(zhǎng)發(fā)育和代謝調(diào)控的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。中科新生命為其提供了iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)和PRM靶向定量蛋白組學(xué)技術(shù)服務(wù)。

 研究材料

實(shí)驗(yàn)組（T）和對(duì)照組（CK）處理7天后的水稻根部PM蛋白，每組三個(gè)生物學(xué)重復(fù)

 技術(shù)路線

步驟1：鋅對(duì)低鎘處理水稻幼苗鋅和鎘積累的影響；

步驟2：鋅脅迫下的定量蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)；

步驟3：差異表達(dá)蛋白的生信分析；

步驟4：鋅-鎘轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的研究；

步驟5：候選蛋白的PRM驗(yàn)證。

 研究結(jié)果

1. 鋅對(duì)低鎘處理水稻幼苗鋅和鎘積累的影響

低濃度的Zn促進(jìn)了水稻幼苗中Cd的吸收和積累，導(dǎo)致Cd含量增加，抑制了水稻幼苗的生長(zhǎng)（協(xié)同效應(yīng)）;中等濃度的Zn抑制了Cd的吸收和積累，促進(jìn)了幼苗的生長(zhǎng)（拮抗作用）。但是，如果Zn濃度過高，雖然Zn可以抑制水稻中Cd的吸收和積累，但不利于水稻幼苗的生長(zhǎng)，甚至對(duì)水稻幼苗產(chǎn)生較高的Zn毒性（拮抗作用）。
 

2. 鋅脅迫下的定量蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)

通過iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)PM蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)，并通過生物信息學(xué)分析經(jīng)過CK和T4處理7天后的水稻根系。從CK水稻根中提取的PM蛋白樣品中共鑒定出14,326個(gè)肽段和4,008個(gè)蛋白質(zhì)，其中192個(gè)上調(diào)，140個(gè)下調(diào)。

圖1 蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定數(shù)量和火山圖

3. 差異表達(dá)蛋白的生信分析

通過層次聚類分析可以看出對(duì)照組和處理組的每三個(gè)重復(fù)分別聚集在一起，具有很高的重復(fù)性。同時(shí)，兩組水稻根系蛋白質(zhì)表達(dá)豐度和表達(dá)水平存在顯著差異。
 

圖2 差異表達(dá)蛋白層次聚類分析

對(duì)差異表達(dá)蛋白（DEPs）的生物學(xué)過程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組分（CC）進(jìn)行GO注釋和功能富集度分析，發(fā)現(xiàn)PM蛋白對(duì)重金屬脅迫非常敏感，在響應(yīng)重金屬脅迫和減輕重金屬的毒性作用方面起著重要作用。

圖3 差異表達(dá)蛋白GO注釋和富集分析
 

KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)與植物代謝相關(guān)的DEPs主要參與谷胱甘肽代謝、苯丙酸生物合成、光合生物固碳等。谷胱甘肽常被用作植物各種代謝過程中的氧化還原活性劑和解毒化合物，也是運(yùn)輸和生物合成的中間產(chǎn)物。在本研究中，高濃度鋅對(duì)水稻有較強(qiáng)的刺激作用，導(dǎo)致谷胱甘肽活性和含量增加，以抵抗鋅處理的毒性效應(yīng)。富集分析發(fā)現(xiàn)，在重金屬處理下，鉑類耐藥性、α-亞麻酸代謝、內(nèi)分泌和其他因素對(duì)鈣重吸收的調(diào)節(jié)、囊泡運(yùn)輸中的圈套相互作用、類黃酮生物合成、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和賴氨酸降解均受到顯著影響。
 

圖4 差異表達(dá)蛋白KEGG通路注釋和富集分析

4. 鋅-鎘轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的研究

在GO分析和KEGG通路分析中記錄了參與Zn²⁺和Cd²⁺轉(zhuǎn)運(yùn)的7個(gè)DEPs。其中，3個(gè)DEPs上調(diào)（A2XQ09、B8B248和B8AAT90）；4個(gè)DEPs下調(diào)（B8AB68、A0A1B1ELU7、A2XPS1和B8BN76）。PPI互作分析顯示，這7個(gè)DEPs中有5個(gè)彼此相互作用。
 

圖5 差異表達(dá)蛋白的PPI互作網(wǎng)絡(luò)

5. 候選蛋白的PRM驗(yàn)證

建立4種候選蛋白質(zhì)（B8AB68，B8AAT9，A0A1B1ELU7和B8BN76）的PRM檢測(cè)方法進(jìn)行靶向驗(yàn)證。結(jié)果表明，蛋白A0A1B1ELU7在不同處理中具有相同的表達(dá)變化。

圖6 候選蛋白的PRM定量結(jié)果

 小編小結(jié)

綜上所述，本文利用相對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)和PRM靶向驗(yàn)證在蛋白質(zhì)水平揭示了脅迫響應(yīng)中Zn/Cd相互作用和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，并找到了與水稻根系重金屬攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的潛在靶蛋白。本研究為水稻根系重金屬脅迫反應(yīng)蛋白生物標(biāo)志物的篩選及抗重金屬脅迫的解毒機(jī)理提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。