2022年7月8日, 锘海線上直播圍繞LS18平鋪光片顯微鏡技術(shù)、生物組織透明化技術(shù)、測樣服務(wù)平臺以及LS18平鋪光片顯微鏡應(yīng)用案例等主題進(jìn)行報告和展示。
 

在報告互動環(huán)節(jié)中，各位老師就目前課題方向提出諸多代表性疑問，讓我們一起回顧下精彩問答。
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Q: 什么是平鋪光片技術(shù)？以及該技術(shù)的控制的原理是怎樣的？

A：平鋪光片技術(shù)是一種新型的選擇性平面照明顯微鏡（SPIM）三維成像技術(shù)，在不增加光片厚度、不降低激發(fā)光片約束能力的情況下，增加SPIM的FOV。如圖1所示，在探測焦平面內(nèi)沿光片長軸方向(y方向)平鋪小而薄的光片，在每個位置拍攝一幅圖像，將所有圖像組合并重建整個FOV的圖像。 

平鋪光片技術(shù)的控制原理：

在成像時，無論是通過移動物鏡或是移動樣本等物理方式，都會影響成像質(zhì)量，造成artifacts。LS18光片顯微鏡創(chuàng)新地采用平鋪光片模式，通過對空間光調(diào)制器加載不同的相位圖以對激發(fā)光束進(jìn)行調(diào)制，實現(xiàn)快速平鋪短而薄的光片，擴(kuò)大了FOV且不影響空間分辨率和光學(xué)層析能力，從而獲得均一的高分辨率3D圖像。空間光調(diào)制器對激發(fā)光相位進(jìn)行調(diào)制幾乎可以解決所有的光片校準(zhǔn)問題，真正地實現(xiàn)顯微鏡儀器的自動校準(zhǔn)，并且性能非常穩(wěn)定，易于操作和維護(hù)。另外，根據(jù)不同樣品的研究需求，LS18光片顯微鏡能夠靈活地調(diào)整光片平鋪次數(shù)以及成像速度，實現(xiàn)不同類型的完整組織器官的3D結(jié)構(gòu)與功能測量。

 

圖1. TLS-SPIM的工作原理，（左）通過快速平鋪小而薄的光片，（右）在每個位置拍攝一幅圖像，將所有圖像組合重建整個FOV的圖像，使得視野范圍內(nèi)各處成像分辨率均一。

關(guān)于平鋪光片技術(shù)的詳細(xì)原理可參考以下文獻(xiàn)：

1. Gao, Liang. Extend the field of view of selective plan illumination microscopy by tiling the excitation light sheet[J]. Optics Express, 2015, 23(5):6102-11.

2. Fu Q , Martin B L , Matus D Q , et al. Imaging multicellular specimens with real-time optimized tiling light-sheet selective plane illumination microscopy[J]. Nature Communications, 2016, 7:11088.
 

Q: 用lectin標(biāo)記血管時，是尾靜脈注射后再取器官然后透明化，還是先透明化再用染色儀器將lectin標(biāo)記上?
A: 血管標(biāo)記透明化和染色順序問題，在實驗案例當(dāng)中，兩種方式我們都有嘗試過，實際上它都是可行的。首先，lectin的尾靜脈注射方式對整個灌注流程來說，需要非常大的技術(shù)把控性。如何做到良好的靜脈內(nèi)注射并維持小鼠一定時間的存活率，對于實驗室新手可能需要多加練習(xí)。由于lectin具有半衰期，可參考發(fā)表文獻(xiàn)中的操作步驟，根據(jù)代謝動力學(xué)來選擇一個合適的時間，需要注意的是在灌注流程過程當(dāng)中剝離取材時間或者說lectin的孵育時間。同時，有些客戶送到我們這邊的樣本可能在前期經(jīng)過灌注后會產(chǎn)生熒光淬滅的問題，我們可以選擇性幫老師做鞏固結(jié)構(gòu)及加強(qiáng)染色步驟。對于加強(qiáng)染色這部分，可用lifecanvas 的SmartBatch+主動式透明化/染色一體電泳儀，亦可采用傳統(tǒng)的被動滲透式方法來實現(xiàn)。
 

Q: 請問哪種透明方法和免疫染色結(jié)合的比較好?
A: 透明化方法和免疫染色的結(jié)合目前為止沒有好壞之分，大組織樣品免疫染色目前是世界性的難題，從目前眾多老師和我們測樣的經(jīng)驗來看，油性染色方法中idisico和Pegasos的方法都比較可行，但是idisco涉及甲醇的脫水步驟，所以對抗體和甲醇的兼容性要求比較高，有條件的用戶我們建議可以先做個兼容性測試，這樣有助于提升后期染色的效率。

通常來說，熒光基團(tuán)在水性的環(huán)境當(dāng)中保存性也更好。所以，如果樣品可以滿足水性透明化方法的前提下，可以盡量嘗試采用水性透明化方法，同時關(guān)注指標(biāo)染色特異性及有效性。

此外，大組織免疫染色還與樣品大小有關(guān)。在不同組織中，如：對于腸道、肺、整腦、整個腦連脊髓、心臟等各類樣品，方法和步驟都有區(qū)別。所以透明化方法一定要和免疫染色指標(biāo)綜合考慮，才能尋找”更優(yōu)解“，跟我們目前有限的經(jīng)驗，需要根據(jù)樣品和染色指標(biāo)來進(jìn)行綜合篩選，尋找合適的組合。
 

Q: matrigel細(xì)胞外基質(zhì)膠可以通過哪幾種透明化方法處理？
A：涉及matrigel細(xì)胞外基質(zhì)的樣品一般多是類器官樣品，此類樣品可以通過多種方法透明進(jìn)行透明化和染色。因為這類樣品相對whole tissue來說一般體積較小，所以這個情況下，實際上有多種透明化方法可嘗試，甚至可以結(jié)合我們更新的膨脹技術(shù)達(dá)到納米級別的分辨，在3D納米級水平完整展示整個類器官樣品形貌。為方便廣大科研老師，我們锘海依托大量實驗案例開發(fā)出的組織透明化試劑盒（#NH-210701）就可以應(yīng)用于類器官的透明化，試劑盒附有詳細(xì)實驗步驟可供老師選擇。
 

Q: 采集的圖像信息量很大，如何進(jìn)行數(shù)據(jù)處理？大量的光學(xué)切片需要拼接，軟件怎么選擇？另外，用什么軟件實現(xiàn)細(xì)胞分割和單細(xì)胞追蹤？定量分析可以采用第三方軟件嗎？圖像輸出是什么格式？

A：平鋪光片顯微鏡采集的大樣本成像數(shù)據(jù)量能達(dá)到幾百GB或TB級別，可通過锘海自主研發(fā)的數(shù)據(jù)預(yù)處理軟件對采集圖像預(yù)處理，輸出.3dtiff格式的原始數(shù)據(jù)供第三方數(shù)據(jù)分析軟件調(diào)用（如圖2所示）。通過第三方軟件或自主拼接軟件即可實現(xiàn)將所有ROI數(shù)據(jù)都拼接在一起，得到一個完整樣品的3D數(shù)據(jù)（如下圖所示）。

圖2. 平鋪光片經(jīng)數(shù)據(jù)提取后得到全視野高分辨率的圖像

目前能實現(xiàn)3D大圖拼接的第三方軟件有很多，如Amira、Imaris，均可以對.3dtiff格式原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，可實現(xiàn)常規(guī)的單個區(qū)域數(shù)據(jù)結(jié)果快速查看、單個區(qū)域數(shù)據(jù)動態(tài)展示、大樣本數(shù)據(jù)整體拼接、大樣本組織整體圖像處理及展示等操作。另外，3D成像的數(shù)據(jù)處理對電腦性能配置也有一定的需求，一般推薦128GB以上內(nèi)存，4T以上的SSD，并需配備較高性能獨立顯卡。

上述這些第三方的專業(yè)圖像處理軟件均有相應(yīng)的圖像分析模塊，可實現(xiàn)分割、單細(xì)胞追蹤及定量分析等功能。
 

Q: 組織透明化對組織本身有化學(xué)損傷嗎？會破壞組織內(nèi)熒光物質(zhì)（如GFP）嗎？

A: 組織透明化方法分為主動式透明化方法和被動式透明化方法兩個大類，以引入外力或生化試劑的被動擴(kuò)散來完成對組織的透明化，組織透明化技術(shù)保留了組織的細(xì)胞間連接和細(xì)微特征。不同的組織透明化方法因其機(jī)理不同，對組織的形態(tài)、透明程度、透明效率、脂質(zhì)留存、內(nèi)源性熒光信號、核酸物質(zhì)、免疫染色等的影響不盡相同。例如被動式透明化方法中的有機(jī)溶劑透明化方法，通過先脫去組織的水分，再利用高折射率的有機(jī)溶液進(jìn)行折射率匹配，雖然達(dá)到很好的透明效果，但是對于熒光蛋白的信號產(chǎn)生淬滅作用。熒光蛋白中的親水基團(tuán)使得親水溶劑透明化方法更有利于熒光的保存。被動式的親水溶劑透明化方法通過浸泡將低折射率的組織液、細(xì)胞液或是高折射率的脂質(zhì)逐漸替換，實現(xiàn)折射率一致，這類方法雖然更利于熒光保存，但耗時較長�；�于CLARITY/SHIELD技術(shù)的主動式透明化方法從保護(hù)熒光蛋白構(gòu)象出發(fā)，不僅能留存內(nèi)源性蛋白、核酸，還通過電泳加速移除脂質(zhì)，使透明化的效率提高。

 

參考文獻(xiàn)：

馮異. 醫(yī)學(xué)組織透明化三維成像 [M]. 復(fù)旦大學(xué)出版社，2020：3-21.

Chung et al., Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature, 2013.

Park et al., Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology, 2019. 
直播回放視頻鏈接：https://v.qq.com/x/page/g3347h98jn8.html?sf=uri

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