利用質譜儀開展的蛋白組學研究中，質譜的掃描速度會影響蛋白的鑒定深度。與傳統(tǒng)3D蛋白組學保留時間、質荷比、離子強度相比，timsTOF Pro雙TIMS/PASEF分離技術，使得蛋白質組學進入4D蛋白質組學新時代。4D分離技術增加第四個維度—離子淌度（mobility），進而大幅提高掃描速度和檢測靈敏度，提升蛋白鑒定的數(shù)量和覆蓋率。

本期推送用2個研究案例帶你了解基于timsTOF Pro的4D蛋白質組學到底好在哪？一起來看看吧！

案例一

發(fā)表在Metabolites上的一項題為“Proteomic Analysis of Tears and Conjunctival Cells Collected withSchirmer Strips Using timsTOF Pro: Preanalytical Considerations”的研究采用timsTOF Pro對淚液及結膜細胞進行蛋白質組學分析，該研究強調了結合高數(shù)據(jù)采集速度和timsTOF Pro中基于離子遷移率的分離，可以為淚液等有限樣本的生物標志物研究帶來新的維度[1]。

研究利用timsTOF Pro，采用全面的蛋白質組學方法，研究從整個 (W, whole) 淚液檢測濾紙 (ScS, Schirmer strips) 及其兩個部分--結膜囊內(nèi)部分 ( B, bulb) 和濾紙的其余部分 (R, rest of the strip) 采集的樣本的人類蛋白質組圖譜。從兩名健康受試者的四次不同就診中收集8個ScS，分為三批，即4W、4B和4R。在W、B和R批次中總共鑒定出1582種蛋白質。在所有已鑒定的蛋白質中，結合蛋白 (43.4%) 和具有催化活性的蛋白 (42.2%) 占分子功能的80%以上。最具代表性的生物過程是細胞過程 (31.2%) 、代謝過程 (20.8%) 和生物調節(jié) (13.1%)。酶是最具代表性的蛋白質類 (41%)，主要由水解酶 (47.5%)、氧化還原酶 (22.1%) 和轉移酶 (16.7%) 組成。與結膜接觸的部分 (B) 可能由于同時收集淚液和細胞蛋白質，因此有助于更多蛋白質的鑒定。

研究對來自三組（W、B和R）的所有已鑒定蛋白質進行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，timsTOF Pro的強大之處在于，它可以分離具有相同質量電荷比 (m/z) 的不同分子，圖1顯示了如何通過對兩個具有幾乎相同質量的靶向肽（白細胞彈性蛋白酶抑制劑和免疫球蛋白）進行測序來評估肽表征。這些蛋白質以相同的保留時間和非常相似的m/z進行共洗脫，但由于timsTOF Pro的三維離子遷移特性，這些肽被區(qū)分開來。

圖1 離子遷移率的可視化熱圖。timsTOF-Pro分析表明，在一個時間點，兩種不同蛋白質的肽離子具有幾乎相同的質量電荷比 (m/z)。圓圈線表示兩個前體離子的m/z和遷移率位置，這兩個前體離子通過平行累積連續(xù)碎裂技術 (PASEF) 進行碎裂。

案例二

發(fā)表在J ProteomeRes上的一項題為“Ultrafast and Reproducible Proteomicsfrom Small Amounts of Heart Tissue Enabled by Azo and timsTOF Pro”的研究開發(fā)了一種由Azo（一種可光降解、與MS兼容的表面活性劑，可有效溶解蛋白質并促進快速胰蛋白酶消化）與Bruker timsTOF Pro相結合的超快全面蛋白質組學方法，該方法通過捕獲離子遷移譜 (TIMS) 和肽的平行累積連續(xù)碎裂技術 (PASEF) 實現(xiàn)更深的蛋白質組覆蓋。研究通過應用該方法分析復雜的人類心臟蛋白質組，并在一次高重復性的一維LC-TIMS-MS/MS運行中，從1 mg人類心臟組織中鑒定出近4000個蛋白質組�？偟膩碚f，預計這種由Azo和timsTOF Pro相結合的超快速、穩(wěn)健和可重復的全面蛋白質方法將普遍適用，并大大加快大規(guī)模定量蛋白質組學研究的速度[2]。

文章中提到，由于心臟蛋白質組是高度復雜的，timsTOF Pro增強的敏感性使蛋白質組覆蓋范圍更廣。timsTOF Pro在不犧牲靈敏度的情況下，通過PASEF大大提高了MS/MS測序速度。在這種模式下，從LC柱中共稀釋的離子在TIMS單元中并行累積，根據(jù)其TIMS遷移率分離為離散的數(shù)據(jù)包，然后，結合快速四極切換，連續(xù)噴射并經(jīng)受MS/MS（圖2B）。該過程顯著增加了從K562全細胞裂解物消化物中鑒定出的作為參考標準的蛋白質組和肽的數(shù)量。利用PASEF，研究能夠從三次注射的200 ng K562全細胞裂解液中鑒定出6364個蛋白質組和60159個肽，相比之下，在PASEF和TIMS被禁用的同一樣本中，只有2531個蛋白質組和15815個肽，這說明了PASEF能夠極大地擴大蛋白質組的覆蓋范圍。

圖2 在timsTOF Pro上使用Azo和PASEF的全面蛋白質組學工作流程。(A) 樣品制備，包括 (1) 組織切割（可擴展至1mg組織），(2) 光降解表面活性劑偶氮中的組織均質，(3) 快速胰蛋白酶消化（最快30分鐘），以及 (4) 在 (5) RPLC-TIMS-MS/MS之前的偶氮降解和C18脫鹽。(B) timsTOF Pro上的PASEF示意圖，展示了

SBC 蛋白研究技術平臺

SBC擁有業(yè)內(nèi)高水平的蛋白研究技術平臺，timsTOF Pro液質聯(lián)用儀、Simoa數(shù)字單分子免疫陣列分析儀、ELISA和Western Blot實現(xiàn)蛋白質組學分析和驗證，涵蓋蛋白質定性、定量和修飾研究。

參考文獻：

[1]Akkurt Arslan M, Kolman I, Pionneau C, et al. Proteomic Analysis of Tears and Conjunctival Cells Collected with Schirmer Strips Using timsTOF Pro: Preanalytical Considerations. Metabolites. 2021;12(1):2. Published 2021 Dec 21. doi:10.3390/metabo12010002

[2]Aballo TJ, Roberts DS, Melby JA, Buck KM, Brown KA, Ge Y. Ultrafast and Reproducible Proteomics from Small Amounts of Heart Tissue Enabled by Azo and timsTOF Pro. J Proteome Res. 2021;20(8):4203-4211. doi:10.1021/acs.jproteome.1c00446