超濾裝置和濾板為分子克隆和 PCR 流程提供更高通量選擇

現(xiàn)如今，幾乎所有生物研究領(lǐng)域都會(huì)涉及分子克隆技術(shù)。所謂的克隆是指，在大多數(shù)細(xì)菌載體（如質(zhì)粒）中插入基因序列，之后，研究人員便可大量復(fù)制所插入的序列。完成克隆之后，即可對(duì)這些序列進(jìn)行操縱和表達(dá)，從而為開展功能性研究提供支持。

傳統(tǒng)的 DNA 片段克隆方法涉及將從染色體、質(zhì)�；蛘沉＋@得的限制性內(nèi)切酶消化片段連接到所選克隆載體的特定位點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)分子克隆技術(shù)需要通過酶促修飾和純化步驟來制備用于連接和轉(zhuǎn)化到細(xì)菌細(xì)胞中的 DNA 序列。通常情況下，要轉(zhuǎn)移用于克隆的 DNA 序列，首先需要使用限制性內(nèi)切酶消化 DNA 以產(chǎn)生末端序列突出端（也稱為粘性末端），這有助于連接到經(jīng)過相似處理且具有兼容粘性末端的載體中。在每個(gè)消化步驟后，需要去除釋放的接頭序列，以免其在隨后的片段連接期間與所需的插入片段競(jìng)爭(zhēng)，從而顯著增加假重組體的數(shù)量。將接頭從所需產(chǎn)物中分離出來的最常用的純化方法是，先進(jìn)行 DNA 電泳，然后從凝膠中回收所需的 DNA 片段。

雖然限制性內(nèi)切酶消化在克隆過程中仍然很重要，但其使用方法已然發(fā)生了改變。相比于單純依靠限制性內(nèi)切酶消化來獲取用于克隆的序列，目前主要采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 來生成和制備用于克隆的序列RNA 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 DNA 或 cDNA 可作為 PCR 擴(kuò)增的模板。PCR 的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)在于，它提供了一種更為直接的方法，可將限制性位點(diǎn)整合到擴(kuò)增引物中，從而引入定向克隆擴(kuò)增序列所需的限制性位點(diǎn)。

標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通常涉及多個(gè)純化步驟，每個(gè)步驟都會(huì)導(dǎo)致大量的產(chǎn)物損失，因此需要大量的起始 DNA 才能保證有足夠的載體和插入材料來完成后續(xù)的連接和轉(zhuǎn)化步驟。1由于需要生成重組 DNA 分子的應(yīng)用數(shù)量龐大，因此需要一種能夠?qū)?PCR 產(chǎn)物或其他來源中的 DNA 片段轉(zhuǎn)化為所需載體的快速方法。

如果樣本量較少，則可以使用 Pall Nanosep^® 等離心超濾裝置來執(zhí)行此類步驟。而對(duì)于通量需求更高的應(yīng)用，可以使用帶有相同超濾膜的 Pall AcroPrep^™ Advance 96 孔過濾板。隨著研究人員需要制作的樣本或構(gòu)建體越來越多，如果能在高通量工作流程中使用過濾板，這無疑十分具有吸引力。

在本科學(xué)簡(jiǎn)報(bào)中，我們將介紹如何在各個(gè)克隆工作流程步驟中應(yīng)用這些超濾裝置來提供更加簡(jiǎn)化的工藝，并將這些步驟與傳統(tǒng)的 PCR 生成片段的亞克隆方法進(jìn)行比較。在優(yōu)化有效靶 DNA 純化的參數(shù)后，我們合成了帶有含限制性位點(diǎn)的末端接頭序列的 PCR 產(chǎn)物。這些接頭經(jīng)過消化后，產(chǎn)生了適合連接的粘性末端。之后，將得到的 DNA 產(chǎn)物進(jìn)行濃縮和脫鹽，同時(shí)通過離心步驟使引物和接頭片段流入廢棄的濾液（圖 1）。得到的 DNA 片段直接在超濾裝置內(nèi)完成與消化載體的連接反應(yīng)，然后轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細(xì)胞。使用超濾裝置，尤其是 Acroprep Advance 96 孔過濾板，能夠大大節(jié)省時(shí)間、人工和起始材料，且轉(zhuǎn)化重組體的數(shù)量與傳統(tǒng)技術(shù)獲得的數(shù)量大致相當(dāng)。

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