文章題目：The immune-suppressive landscape in lepromatous leprosy revealed bysingle-cell RNA sequencing

發(fā)表時(shí)間：2022年1月

發(fā)表期刊：Cell Discovery（IF=10.849）

關(guān)鍵詞：麻風(fēng)病，scRNA-seq，流式細(xì)胞分析，mIHC

研究對(duì)象：人皮膚活檢，人外周血

研究方法：單細(xì)胞測(cè)序+流式細(xì)胞分析+多色免疫熒光驗(yàn)證

發(fā)表單位：山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）

麻風(fēng)病是由麻風(fēng)桿菌（Mlep）引起的一種慢性傳染病，主要病變?cè)谄つw和周?chē)�神�?jīng)，可導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的殘疾和畸形。麻風(fēng)病曾在全球廣泛流行數(shù)千年，即便是今天，全球每年新發(fā)現(xiàn)的病例數(shù)仍超過(guò)20萬(wàn)，其中60%是瘤型麻風(fēng)（L-LEP）。由于麻風(fēng)病具有顯著的基因組保守性，一直被認(rèn)為是一種有研究?jī)r(jià)值的疾病模型，可用于研究人類(lèi)對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)。然而，Mlep對(duì)宿主免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)以及促進(jìn)Mlep增殖的L-LEP免疫妥協(xié)的分子機(jī)制尚未被充分闡明。在免疫研究領(lǐng)域中，越來(lái)越多的文章都采用了【單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)+流式細(xì)胞分析技術(shù)+多色免疫熒光技術(shù)】“組合拳”的打法。本期推送為大家?guī)��?lái)的就是采用這套“組合拳”開(kāi)展麻風(fēng)病免疫抑制研究的文章。

研究思路圖

· 文章摘要 ·

瘤型麻風(fēng)（L-LEP）是由Mlep在巨噬細(xì)胞中大量增殖引起的，是研究細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌逃避或調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)分子機(jī)制的理想疾病模型。本研究對(duì)L-LEP患者和健康對(duì)照組的皮膚活檢和外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）分別進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序，結(jié)果顯示在L-LEP病變中，表現(xiàn)出高表達(dá)水平LIPA的巨噬細(xì)胞亞群中APOE表達(dá)顯著上調(diào)，與主要組織相容性復(fù)合體II基因HLA-DQB2和MIF呈負(fù)相關(guān)，而MIF編碼一種促炎癥和抗微生物細(xì)胞因子。在L-LEP病變中，CD8⁺T細(xì)胞的耗竭表現(xiàn)為TIGIT和LAG3的高表達(dá)。此外，在L-LEP病變中觀察到抑制性免疫受體介導(dǎo)的皮膚免疫細(xì)胞間相互作用顯著增強(qiáng)。對(duì)于PBMC，HLA-DR^highFBP1^high單核細(xì)胞亞群中，APOE的高表達(dá)水平和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的擴(kuò)張被發(fā)現(xiàn)與L-LEP有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)揭示了L-LEP患者的主要抑制情況，為干預(yù)由細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌引起的持續(xù)感染提供了潛在靶點(diǎn)。

· 研究結(jié)果 ·

scRNA-seq揭示皮膚免疫細(xì)胞組成

對(duì)5名L-LEP患者的病變皮膚和5名健康對(duì)照組（HC）的正常皮膚活檢樣本（共60,405個(gè)細(xì)胞）進(jìn)行scRNA-seq，確定了包括T/自然殺傷（NK）細(xì)胞、B細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（DC/Mac）在內(nèi)的10種主要細(xì)胞類(lèi)型（圖1）。進(jìn)一步對(duì)DC/Mac細(xì)胞群和T/NK細(xì)胞群進(jìn)行亞群分析，發(fā)現(xiàn)了多種細(xì)胞亞型，并對(duì)健康和疾病患者的細(xì)胞各類(lèi)型細(xì)胞比例進(jìn)行了比較�？傊�，研究確定了9種皮膚免疫細(xì)胞亞型，包括B細(xì)胞、CD4⁺T、CD8⁺T、NK、肥大細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、Mac_LIPA、Mac_FCN1和CD1C⁺DC（圖2）。

圖1 scRN-seq數(shù)據(jù)聚類(lèi)顯示的主要皮膚細(xì)胞類(lèi)型

 

圖2 皮膚DC/Mac和T/NK細(xì)胞群的亞群分析
 

具有免疫調(diào)節(jié)功能的APOE在L-LEP病變的Mac_LIPA中顯著上調(diào)

研究發(fā)現(xiàn)，Mac_LIPA亞群表達(dá)了顯著高水平的APOE（圖3a）。對(duì)L-LEP患者和HC之間差異表達(dá)基因（DEG）的分析表明，APOE顯著上調(diào)（圖3b，c）。此外，在Mac_LIPA細(xì)胞中，APOE的表達(dá)與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）II基因HLA-DQB2和MIF的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，MIF編碼一種具有分枝桿菌控制功能的促炎癥細(xì)胞因子（圖3b，d）。在驗(yàn)證隊(duì)列1中，bulkRNA-seq也顯示了L-LEP中APOE的顯著上調(diào)（圖3e）。mIHC實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了APOE在L-LEP病變（驗(yàn)證隊(duì)列2）中的高表達(dá)及其與巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD68的共定位（圖3f）。用Mlep感染人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞后，Mlep感染的巨噬細(xì)胞上清液中的ApoE蛋白濃度顯著高于未感染的巨噬細(xì)胞，尤其是在感染后48小時(shí)，這表明Mlep感染可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞上調(diào)ApoE的表達(dá)（圖3g）。
 
綜上所述， Mlep感染引起的APOE高表達(dá)與巨噬細(xì)胞中促炎癥和抗菌固有免疫反應(yīng)受抑制之間存在相關(guān)性。

圖3 在L-LEP的Mac_LIPA中，具有免疫調(diào)節(jié)功能的APOE上調(diào)

L-LEP病變中的CD8⁺T細(xì)胞呈耗竭狀態(tài)

研究分析了T細(xì)胞中抑制性受體（耗竭標(biāo)志物）：PDCD1（PD-1）、CTLA-4、LAG3、TIGIT和HAVCR2（TIM-3）的表達(dá)。與HC相比，在L-LEP病變中，所有五種耗竭標(biāo)志物基因在CD4⁺和CD8⁺T細(xì)胞中的表達(dá)均有增加的趨勢(shì)（圖4a）。值得注意的是，在患者的CD8⁺T細(xì)胞中，觀察到TIGIT和LAG3顯著上調(diào)（圖4a，b），這意味著L-LEP病變中CD8⁺T細(xì)胞耗盡。而在CD4⁺T細(xì)胞中，在L-LEP和HC之間未觀察到這五種耗竭標(biāo)記物的表達(dá)水平存在顯著差異（圖4a）。此外，驗(yàn)證隊(duì)列1的bulkRNA-seq還表明，TIGIT和LAG3在L-LEP中顯著上調(diào)（圖4c）。驗(yàn)證隊(duì)列2通過(guò)mIHC證實(shí)了與HC相比，TIGIT和LAG3的高表達(dá)以及TIGIT和LAG3與CD8⁺T細(xì)胞在L-LEP病變中的共定位（圖4d，e）。

圖4 L-LEP病變中的CD8⁺T細(xì)胞呈耗竭狀態(tài)

在L-LEP病變中，抑制性受體介導(dǎo)的皮膚免疫細(xì)胞之間的相互作用增強(qiáng)

分別對(duì)L-LEP患者和HC進(jìn)行了皮膚免疫細(xì)胞的配體和受體相互作用分析。在L-LEP病變中，觀察到CTLA4/CD86、PDCD1（PD-1）/PDCD1LG2、LGALS9/HAVCR2（TIM-3）、PVR/TIGIT、TIGIT/NECTIN2和TIGIT/NECTIN3介導(dǎo)的相互作用顯著增強(qiáng)。CD8⁺T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞之間相互作用增強(qiáng)，在CTLA4/CD86、PDCD1/PDCD1LG2和TIGIT/NECTN2中最為明顯，這與CD8⁺T細(xì)胞的耗盡狀態(tài)一致。有趣的是，在HC中，PVR/TIGIT相互作用是由Mac_FCN1和T細(xì)胞介導(dǎo)的，而在L-LEP中，這種相互作用增強(qiáng)，并且僅在Mac_LIPA和T細(xì)胞之間出現(xiàn)，這意味著Mac_LIPA在L-LEP中起著關(guān)鍵作用（圖5）�？偟膩�(lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明L-LEP病變中抑制性受體介導(dǎo)的相互作用與免疫抑制之間存在關(guān)聯(lián)。

圖5 抑制性受體介導(dǎo)的皮膚免疫細(xì)胞間的相互作用

• L-LEP患者PBMC的免疫抑制譜

對(duì)7名L-LEP患者和6名HC的PBMC（共110477個(gè)細(xì)胞）進(jìn)行scRNA-seq，確定了15個(gè)亞群（圖6）。

圖6 scRNA-seq數(shù)據(jù)聚類(lèi)顯示PBMC組成

對(duì)髓樣細(xì)胞進(jìn)行亞群發(fā)現(xiàn)，APOE主要由Mono3（HLA-DR^highFBP1^high）亞群表達(dá)（圖7b），且在L-LEP患者的該亞群中觀察到APOE顯著上調(diào)（圖8a）。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)也在蛋白質(zhì)水平上證實(shí)了該單核細(xì)胞亞群中APOE上調(diào)。通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了L-LEP患者血清中的ApoE蛋白濃度也明顯高于HC（驗(yàn)證隊(duì)列2）（圖8b）�？紤]到APOE上述發(fā)現(xiàn)，研究者認(rèn)為單核細(xì)胞亞群Mono3（HLA-DR^highFBP1^high）可能參與了Mlep感染的發(fā)病機(jī)制。

圖7 PBMC髓樣細(xì)胞亞群分析

在T細(xì)胞中，觀察到L-LEP患者的Treg（FOXP3⁺IL2RA（CD25）⁺）深度擴(kuò)張（圖8c）。進(jìn)一步的流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，患者PBMC中CD4⁺FOXP3⁺、CD4⁺CD25⁺和CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺Treg細(xì)胞的比例均顯著高于HC（驗(yàn)證隊(duì)列2）（圖8d-g）。分別對(duì)L-LEP患者和HC的PBMC亞群進(jìn)行了配體和受體相互作用分析，發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞與其他細(xì)胞類(lèi)型的相互作用顯著增加（圖8h）。總之，HLA-DR^highFBP1^high單核細(xì)胞亞群中APOE的高表達(dá)和Treg細(xì)胞的擴(kuò)張可能有助于L-LEP患者PBMC的免疫抑制。

圖8 L-LEP患者HLA-DR^highFBP1^high單核細(xì)胞亞群中APOE的上調(diào)和PBMC中Treg的擴(kuò)增

· 文章總結(jié) ·  

該研究通過(guò)【scRNA-seq+流式細(xì)胞術(shù)+mIHC】聯(lián)合研究策略，以單細(xì)胞分辨率展示了L-LEP的轉(zhuǎn)錄組學(xué)圖譜，揭示了疾病相關(guān)和免疫受損的單核細(xì)胞、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞亞群的免疫特征。這些細(xì)胞亞群及其各自具有免疫抑制功能的基因代表了預(yù)防和治療L-LEP和其他由細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌引起的持續(xù)性傳染病的潛在靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

Mi Z, Wang Z, Xue X, et al. The immune-suppressive landscape inlepromatous leprosy revealed by single-cell RNA sequencing. Cell Discov.2022;8(1):2. Published 2022 Jan 11. doi:10.1038/s41421-021-00353-3