3D腫瘤球培養(yǎng)的觀察與精細分離解決方案
軟硬兼施—Leica打造的3D腫瘤球培養(yǎng)的解決方案
生命誕生于3D環(huán)境，所以傳統的2D細胞培養(yǎng)方法，雖然可以保證細胞的生長和對外界刺激產生生理反應，但是和實際生活環(huán)境的巨大差異會導致大部分生理功能受限。比如，2D培養(yǎng)環(huán)境下的細胞間的相互作用是XY軸的，只是細胞層之間的作用，缺乏Z軸方向的影響，這樣就沒有養(yǎng)料、氧氣和外界刺激物（如：藥物處理）的梯度滲透作用。而3D培養(yǎng)環(huán)境下細胞可以變成細胞球，從而可以體現出Z軸細胞之間的力作用和各種物質的滲透梯度，和體內的差異相較2D細胞層會大大縮小，從而提高體外細胞實驗的準確性。
最近的統計表明每年會有370萬新增癌癥病例在歐洲發(fā)生，這些疾病會導致20%的死亡率。利用體外培養(yǎng)的腫瘤細胞來高通量的篩選新的有效的藥物對于挽救癌癥病人非常重要，而3D培養(yǎng)的腫瘤細胞球是合適的模型，但是這種細胞模型也有其瓶頸。因為3D細胞球的培養(yǎng)方案不統一，而且生長環(huán)境較之2D復雜，所以最終養(yǎng)成的球體異質性會較之2D細胞層嚴重，而藥物的篩選需要有盡量均一的樣本，這樣最終得到的藥物敏感數據才準確可信。為了解決這樣的情況，需要對培養(yǎng)出來的腫瘤球進行挑選，然后放到孔板中，但是傳統的挑選方法是用人為的用肉眼挑選，這樣會導致效率的低下，而且個人的差異會導致標準不統一，再者如果直徑500微米一下的球體挑選難度就會更大。此外，對3D球體在鏡下和攝像頭下的成像也容易受到光源、培養(yǎng)基濃度和培養(yǎng)器皿的形狀而影響，從而更加增加觀察者肉眼判讀的不統一性。1、2、3、4、5、6、7、8、9、10
而現在市面上進行細胞球培養(yǎng)和掃描/拍攝的設備，但是還沒有能進行挑選和轉移設備，為了解決這一問題匈牙利的Istvan Grexa等人利用徠卡顯微系統的S9i體式鏡觀察和拍攝，讓深度學習軟件對球體的形態(tài)進行分析和判別，然后讓顯微操作系統和注射器泵來挑出統一的3D腫瘤細胞球（從T-47D、5-8F和Huh-7D12三個細胞系培養(yǎng)而來，培養(yǎng)方案各不相同）并從培養(yǎng)皿轉移到孔板中。他們給這套系統命名為SpheroidPicker。11
Leica S9i體視鏡獨有的FusionOptics融合光學系統，可以同時兼顧長景深和高分辨率，而3D球體因為有Z軸的深度，所以使用這種技術可以保證完整而清晰的觀察到球體。且放大倍率可以到55x，實現9：1的變倍比，實現總覽到細節(jié)的快速切換。此外，該機型搭配了10MP的攝像頭。優(yōu)秀的光學素質和高成像的分辨率可以方便為深度學習軟件來分析。再加之有122 mm工作距離，從而有足夠的空間來搭配上圖中的自動化顯微操作系統和注射器。
細胞球的精確分割是整個細胞選擇培養(yǎng)流程的重中之重。在自動選擇過程中需要兼顧靈敏性及準確度問題，以排除尺寸過小、過大或外形不規(guī)則的細胞球個體。由于細胞球通常不會彼此接觸或重疊——這一特點恰巧符合U-Net 神經網絡的設計，因此通過U-Net 神經網絡訓練的深度學習模型可以很好的解決精準自動地選擇細胞球這一難題。而同為Leica旗下的Aivia 人工智能圖像分析軟件，是一款具有處理深度學習模型的軟件，此外其還為使用者提供了Python 接口，用戶可以調用公開的三方模型或分析工具，如發(fā)布在GitHub 上的資源，也可以根據實驗需要編寫符合特定需求的插件，制定一體化的分析流程，提高整體分析流程的效率。
經過這套系統轉移后的球體狀態(tài)如何呢？作者通過Leica SP8共聚焦檢測了形態(tài)和活力相關的標記物（用calcein AM、Eth-D1和Hoechst3342），通過短時間（轉移前后馬上對比）和長時間（0、24、48小時），發(fā)現通過SpheroidPicker的轉移操作幾乎不會影響細胞球的活力。
而這套系統的最終效果如何呢？要求專家和SpheroidPicker挑選面積為21,000-29,000 μm2、最小圓度為0.815的小球。對比最終結果，發(fā)現SpheroidPicker對挑選面積和圓度的范圍控制比專家更精準，其操作28次，其中26個小球被成功挑出，25個轉移成功，成功率更高。。
3D球體是現在最有前途的體外篩藥模型，讓細胞XYZ空間展現出較之2D單細胞層更多更準確的生理功能，但是其培養(yǎng)方法的不統一造成較難獲得均一化個體，需要后期的挑選才可以作為可信的篩藥對象，而借助能擁有優(yōu)秀光學素質能兼顧清晰和3D景深Leica S9i體視鏡加上深度學習軟件（Leica Aivia可以用來開發(fā)此功能），可以自動化的來做挑選和轉移的工作，從而讓3D球體成為可信高效的體外篩藥模型。
參考文獻
1. Horvath, P. et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nat. Rev. Drug Discov. 15(11), 751–769. https:// doi. org/ 10.1038/ nrd. 2016. 175 (2016).
2. Brüningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U. & Ter Haar, G. 3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments. Sci. Rep. 10(1), 1653. https:// doi. org/ 10. 1038/ s41598- 020- 58569-4 (2020).
3. Carragher, N. et al. Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models. Nat. Rev. Drug Discov. 17(8),606. https:// doi. org/ 10. 1038/ nrd. 2018. 99 (2018).
4. Szade, K. et al. Spheroid-plug model as a tool to study tumor development, angiogenesis, and heterogeneity in vivo. Tumour Biol.37(2), 2481–2496. https:// doi. org/ 10. 1007/ s13277- 015- 4065-z (2016).
5. Sawant-Basak, A. & Scott Obach, R. Emerging models of drug metabolism, transporters, and toxicity. Drug Metab. Dispos. 46(11),1556–1561. https:// doi. org/ 10. 1124/ dmd. 118. 084293 (2018).
6. Cesarz, Z. & Tamama, K. Spheroid culture of mesenchymal stem cells. Stem Cells Int. https:// doi. org/ 10. 1155/ 2016/ 91763 57 (2016).
7. Nath, S. & Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacol. Ther.163, 94–108. https:// doi. org/ 10. 1016/j. pharm thera. 2016. 03. 013 (2016).
8. Cisneros Castillo, L. R., Oancea, A.-D., Stüllein, C. & Régnier-Vigouroux, A. Evaluation of consistency in spheroid invasion assays.Sci. Rep. 6, 28375. https:// doi. org/ 10. 1038/ srep2 8375 (2016).
9. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R. & Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: Considerations and practical approach.Nat. Protoc. 4(3), 309–324. https:// doi. org/ 10. 1038/ nprot. 2008. 226 (2009).
10. Bresciani, G. et al. Evaluation of spheroid 3D culture methods to study a pancreatic neuroendocrine neoplasm cell line. Front.Endocrinol. 10, 682. https:// doi. org/ 10. 3389/ fendo. 2019. 00682 (2019).
11. Istvan Grexa et al. SpheroidPicker for automated 3D cell culture manipulation using deep learning. Scientific Repotrs (2021) 11:14813. https://doi.org/10.1038/s41598-021-94217-1
相關產品：s9、Aivia
了解更多：徠卡顯微
生命誕生于3D環(huán)境，所以傳統的2D細胞培養(yǎng)方法，雖然可以保證細胞的生長和對外界刺激產生生理反應，但是和實際生活環(huán)境的巨大差異會導致大部分生理功能受限。比如，2D培養(yǎng)環(huán)境下的細胞間的相互作用是XY軸的，只是細胞層之間的作用，缺乏Z軸方向的影響，這樣就沒有養(yǎng)料、氧氣和外界刺激物（如：藥物處理）的梯度滲透作用。而3D培養(yǎng)環(huán)境下細胞可以變成細胞球，從而可以體現出Z軸細胞之間的力作用和各種物質的滲透梯度，和體內的差異相較2D細胞層會大大縮小，從而提高體外細胞實驗的準確性。
最近的統計表明每年會有370萬新增癌癥病例在歐洲發(fā)生，這些疾病會導致20%的死亡率。利用體外培養(yǎng)的腫瘤細胞來高通量的篩選新的有效的藥物對于挽救癌癥病人非常重要，而3D培養(yǎng)的腫瘤細胞球是合適的模型，但是這種細胞模型也有其瓶頸。因為3D細胞球的培養(yǎng)方案不統一，而且生長環(huán)境較之2D復雜，所以最終養(yǎng)成的球體異質性會較之2D細胞層嚴重，而藥物的篩選需要有盡量均一的樣本，這樣最終得到的藥物敏感數據才準確可信。為了解決這樣的情況，需要對培養(yǎng)出來的腫瘤球進行挑選，然后放到孔板中，但是傳統的挑選方法是用人為的用肉眼挑選，這樣會導致效率的低下，而且個人的差異會導致標準不統一，再者如果直徑500微米一下的球體挑選難度就會更大。此外，對3D球體在鏡下和攝像頭下的成像也容易受到光源、培養(yǎng)基濃度和培養(yǎng)器皿的形狀而影響，從而更加增加觀察者肉眼判讀的不統一性。1、2、3、4、5、6、7、8、9、10
而現在市面上進行細胞球培養(yǎng)和掃描/拍攝的設備，但是還沒有能進行挑選和轉移設備，為了解決這一問題匈牙利的Istvan Grexa等人利用徠卡顯微系統的S9i體式鏡觀察和拍攝，讓深度學習軟件對球體的形態(tài)進行分析和判別，然后讓顯微操作系統和注射器泵來挑出統一的3D腫瘤細胞球（從T-47D、5-8F和Huh-7D12三個細胞系培養(yǎng)而來，培養(yǎng)方案各不相同）并從培養(yǎng)皿轉移到孔板中。他們給這套系統命名為SpheroidPicker。11
Leica S9i體視鏡獨有的FusionOptics融合光學系統，可以同時兼顧長景深和高分辨率，而3D球體因為有Z軸的深度，所以使用這種技術可以保證完整而清晰的觀察到球體。且放大倍率可以到55x，實現9：1的變倍比，實現總覽到細節(jié)的快速切換。此外，該機型搭配了10MP的攝像頭。優(yōu)秀的光學素質和高成像的分辨率可以方便為深度學習軟件來分析。再加之有122 mm工作距離，從而有足夠的空間來搭配上圖中的自動化顯微操作系統和注射器。
細胞球的精確分割是整個細胞選擇培養(yǎng)流程的重中之重。在自動選擇過程中需要兼顧靈敏性及準確度問題，以排除尺寸過小、過大或外形不規(guī)則的細胞球個體。由于細胞球通常不會彼此接觸或重疊——這一特點恰巧符合U-Net 神經網絡的設計，因此通過U-Net 神經網絡訓練的深度學習模型可以很好的解決精準自動地選擇細胞球這一難題。而同為Leica旗下的Aivia 人工智能圖像分析軟件，是一款具有處理深度學習模型的軟件，此外其還為使用者提供了Python 接口，用戶可以調用公開的三方模型或分析工具，如發(fā)布在GitHub 上的資源，也可以根據實驗需要編寫符合特定需求的插件，制定一體化的分析流程，提高整體分析流程的效率。
經過這套系統轉移后的球體狀態(tài)如何呢？作者通過Leica SP8共聚焦檢測了形態(tài)和活力相關的標記物（用calcein AM、Eth-D1和Hoechst3342），通過短時間（轉移前后馬上對比）和長時間（0、24、48小時），發(fā)現通過SpheroidPicker的轉移操作幾乎不會影響細胞球的活力。
而這套系統的最終效果如何呢？要求專家和SpheroidPicker挑選面積為21,000-29,000 μm2、最小圓度為0.815的小球。對比最終結果，發(fā)現SpheroidPicker對挑選面積和圓度的范圍控制比專家更精準，其操作28次，其中26個小球被成功挑出，25個轉移成功，成功率更高。。
3D球體是現在最有前途的體外篩藥模型，讓細胞XYZ空間展現出較之2D單細胞層更多更準確的生理功能，但是其培養(yǎng)方法的不統一造成較難獲得均一化個體，需要后期的挑選才可以作為可信的篩藥對象，而借助能擁有優(yōu)秀光學素質能兼顧清晰和3D景深Leica S9i體視鏡加上深度學習軟件（Leica Aivia可以用來開發(fā)此功能），可以自動化的來做挑選和轉移的工作，從而讓3D球體成為可信高效的體外篩藥模型。
參考文獻
1. Horvath, P. et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nat. Rev. Drug Discov. 15(11), 751–769. https:// doi. org/ 10.1038/ nrd. 2016. 175 (2016).
2. Brüningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U. & Ter Haar, G. 3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments. Sci. Rep. 10(1), 1653. https:// doi. org/ 10. 1038/ s41598- 020- 58569-4 (2020).
3. Carragher, N. et al. Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models. Nat. Rev. Drug Discov. 17(8),606. https:// doi. org/ 10. 1038/ nrd. 2018. 99 (2018).
4. Szade, K. et al. Spheroid-plug model as a tool to study tumor development, angiogenesis, and heterogeneity in vivo. Tumour Biol.37(2), 2481–2496. https:// doi. org/ 10. 1007/ s13277- 015- 4065-z (2016).
5. Sawant-Basak, A. & Scott Obach, R. Emerging models of drug metabolism, transporters, and toxicity. Drug Metab. Dispos. 46(11),1556–1561. https:// doi. org/ 10. 1124/ dmd. 118. 084293 (2018).
6. Cesarz, Z. & Tamama, K. Spheroid culture of mesenchymal stem cells. Stem Cells Int. https:// doi. org/ 10. 1155/ 2016/ 91763 57 (2016).
7. Nath, S. & Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacol. Ther.163, 94–108. https:// doi. org/ 10. 1016/j. pharm thera. 2016. 03. 013 (2016).
8. Cisneros Castillo, L. R., Oancea, A.-D., Stüllein, C. & Régnier-Vigouroux, A. Evaluation of consistency in spheroid invasion assays.Sci. Rep. 6, 28375. https:// doi. org/ 10. 1038/ srep2 8375 (2016).
9. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R. & Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: Considerations and practical approach.Nat. Protoc. 4(3), 309–324. https:// doi. org/ 10. 1038/ nprot. 2008. 226 (2009).
10. Bresciani, G. et al. Evaluation of spheroid 3D culture methods to study a pancreatic neuroendocrine neoplasm cell line. Front.Endocrinol. 10, 682. https:// doi. org/ 10. 3389/ fendo. 2019. 00682 (2019).
11. Istvan Grexa et al. SpheroidPicker for automated 3D cell culture manipulation using deep learning. Scientific Repotrs (2021) 11:14813. https://doi.org/10.1038/s41598-021-94217-1
相關產品：s9、Aivia
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