三陰性乳腺癌是一種具有臨床侵襲性的腫瘤亞型, 具有高轉移率, 復發(fā)率和耐藥性。目前還沒有臨床批準的針對這種疾病的小分子靶向療法, 所以發(fā)現新的治療靶點有著迫切需要。源自患者的基于細胞的3D 癌癥模型是癌癥研究,藥物開發(fā)和個性化醫(yī)療的非常有價值的工具。原代腫瘤衍生模型可以概括腫瘤異質性和形態(tài), 以及復雜的遺傳和分子組成, 從而加速藥物開發(fā)和藥物測試。然而, 執(zhí)行 3D 檢測的復雜性仍然是采用這種化合物篩選方法的障礙。
在本研究中, 我們描述了一種成像和細胞培養(yǎng)方法的自動化, 這些方法可以批量進行復雜的基于3D細胞的實驗。我們開發(fā)了一個整合的工作單元, 其中包括一臺IXM-C HT.ai共聚焦成像系統(tǒng),一臺自動化CO2培養(yǎng)箱, 一臺自動化移液工作站(Biomek i7),和一臺協(xié)作機械臂。 工作單元流程設置能通過高內涵成像實現化合物測試自動化, 培養(yǎng)監(jiān)測, 以及藥物表型效應的評價。 腫瘤類器官由分離自患者來源的腫瘤TU-BcX-4IC原代細胞形成, 該外植體代表具有三陰性乳腺癌亞型的化生性乳腺癌。在與化合物一起孵育期間, 每天使用透射光成像監(jiān)測腫瘤類器官,借助基于機器學習的圖像分析, 可以表征腫瘤類器官的大小, 直徑, 完整性和光密度。對于終點測定, 腫瘤類器官用細胞活性染料染色并使用自動共焦成像系統(tǒng)成像。我們表征了多個可用于研究腫瘤表型和化合物效應的定量參數,包括大小和完整性, 細胞形態(tài)和活力, 以及確定各種細胞標志物的存在和表達水平。

產生腫瘤類器官和PDX類器官的方法 (PDXO) 如之前所述(Matossian 等人2021)。 將原發(fā)性腫瘤樣本植入SCID/Beige小鼠體內并表現出快速的腫瘤生長, 14 天達到最大腫瘤體積>1000 mm3, 然后從 2D 培養(yǎng)中擴增的樣本中生成細胞系。 腫瘤類器官由2D擴增的 4IC 細胞形成的。 4IC 細胞每孔鋪約2000個 (在U 型底低吸附384 板中, Corning) 并孵育48小時, 直到它們形成緊密的腫瘤類器官。 4IC 細胞使用帶補充葡萄糖的Advanced DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)含有 NEAA,2mM 谷氨酰胺和胰島素 120μg/L, 10% FBS (Gibco12491-015)。 對于代謝測定,類腫瘤用DMEM + 10% 透析血清培養(yǎng)(2mM 谷氨酰胺,5mM 葡萄糖,無酚紅)。

細胞監(jiān)測和成像
在 ImageXpress Confocal HT.ai 高內涵成像系統(tǒng)(MolecularDevices)上使用 MetaXpress 高內涵圖像分析軟件采集熒光圖像和透射光 (TL) 。 腫瘤類器官圖像在 TL 中獲得, 間隔約
60 μm。 Z-圖片組圖像是通過 10X 或 20X 物鏡使用共聚焦模式獲得的。使用MetaXpress或 IN Carta™進行分析。
細胞培養(yǎng)自動化和成像流程
類器官的自動成像和分析對于定量評估類器官的表型變化以及增加實驗和測試的通量非常重要。我們構建了一個自動化的集成系統(tǒng), 可以自動監(jiān)測, 維護和表征類器官和干細胞的生長和分化, 以及測試各種化合物的效果。自動化系統(tǒng)包括 ImageXpress Confocal HT.ai 系統(tǒng)和分析軟件, 自動化CO2 培養(yǎng)箱, Biomek i7移液工作站, 機械臂和軌道。 由GreenButton Go 解決方案實現機械自動化。

原代樣本→ SCID 小鼠→2D 擴增 →3D 微組織 →化合物庫篩選

Figure 1. A.腫瘤類器官形成在鋪板后48h, TL圖像 (10X)。 B.化合物處理后的培養(yǎng)的腫瘤類器官。 C.腫瘤類器官使用
E-cadherin(綠色), CD44(紅色)和Hoechst染色,共聚焦圖像, 20x。 D.腫瘤類器官以化合物處理5天然后用Hoechst染料(藍色), 鈣黃綠素AM (綠色) and EtHD
(紅色)染色, 10X物鏡,類器官以共聚焦選項成像, 15張圖像的Z-圖片組每張間隔10 µm,展示的是最大投影疊加圖像。 使用Custom Module Editor
(MetaXpress軟件)分析識別類器官,細胞核,活細胞和死細胞。

細胞培養(yǎng), 化合物處理和成像自動化
Biomek自動化用于化合物稀釋, 細胞處理和染色。 然后每天通過自動成像培養(yǎng)和監(jiān)測腫瘤類器官。通過基于AI的圖像分析自動檢測和表征腫瘤表型,密度和大小。對于終點法測定, 細胞用Hoechst,鈣黃綠素AM 和EtHD的組合染色,并使用Custom Module Editor進行分析,以進行復雜的表型分析。
鑒定來自NCI 庫的靶向針對化生性三陰性乳腺癌腫瘤類器官的化合物
3D 腫瘤類器官培養(yǎng)為疾病建模和化合物效應評估提供了非常有用的工具。自動化的工作流程允許大批量合物篩選分析, 并提高了分析的重現性和簡便性。腫瘤類器官的自動成像和分析對于定量評估腫瘤類器官的表型變化和監(jiān)測生物反應的復雜性很重要。來自成像的多種參數結果包括腫瘤類器官的大小, 完整性(面積), 不同標志物的密度, 細胞計數和其他特征。
我們以5個濃度10X梯度稀釋測試了NCI庫中1 68 種化合物的效果: 10nM, 100nM, 1000nM (1μM), 10μM和1 00μM。然后, 我們使用腫瘤類器官完整性 (腫瘤類器官面積)和活力(活細胞%)的評估來識別不同濃度下的Hits化合物。鑒定出了幾種藥物, 這些藥物顯示出了其靶向對傳統(tǒng)癌癥治療耐藥的腫瘤亞型的功效。下面列出的藥物顯示了其在指定濃度下對類腫瘤表型的功效(較高濃度也包括列出的較低濃度有效的藥物)。

Figure 2. A. 3D癌癥微組織的自動圖像分析是使用透射光圖像 (10X)和In Carta軟件中基于AI的圖像分析完成的(分析圖例以紫色表示)。 B.使用
ImageXpress軟件的Custom Module Editor功能進行熒光圖像的終點法分析。 顯示圖像和分析圖例。 對細胞評價和類器官表征進行了多次測量。

所選化合物的劑量反應和次級表征
選擇一組化合物進行二次后續(xù)分析�；�合物在 1-10000 nM 范圍內7個濃度進行了測試。 EC50值由使用腫瘤類器官解體度測量來確定的。
結論
• 我們展示了使用源自原代三陰化生癌細胞樣品的3D腫瘤類器官的化合物篩選實驗。我們測試了NCI庫中的168種化合物,涵蓋了多種濃度, 并確定了幾種在3D細胞實驗中顯示出功效的化合物。
• 通過整合的自動成像系統(tǒng), 移液工作站, 自動培養(yǎng)箱和協(xié)作機械臂, 使腫瘤類器官檢測和化合物處理過程自動化。 這些儀器實現了對3D細胞模型進行自動化細胞培養(yǎng), 維護和化合物處理, 而使這些3D模型可用于癌癥生物學化合物篩選。
• 共聚焦成像與3D分析相結合, 可以對類器官內的細胞進行復雜的定量分析,并對具有不同表型的細胞進行計數和測量。該方法可用于測試抗癌化合物的效果和疾病建模。