在篩選的共培養(yǎng)條件下雙向預誘導提高 hUCMSCs 成骨能力的新方法
為了實現(xiàn)骨缺損的非侵入性和更安全的定制化康復，間充質干細胞（MSCs）被建議用于基于3D打印（3DP）制成的骨支架定制的生物活性組織工程骨移植物，從而為臨床環(huán)境提供有希望的證據(jù)。然而，人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）的獲取數(shù)量不能滿足具有侵襲性過程的骨修復的巨大需求，并且細胞活性受供體年齡和健康狀況的影響很大，極大地限制了臨床應用。相比之下，人臍帶間充質干細胞（hUCMSCs），存在于臍帶華通氏膠（Wharton’s jelly）和血管周圍組織中的一種間充質干細胞，具有更高的細胞產(chǎn)量、快速的增殖能力、大量分泌與細胞遷移、炎癥、免疫調節(jié)、血管生成相關的細胞因子。最重要的是，hUCMSCs 不表達負責同種免疫反應的主要組織相容性復合物II（MHC II）和免疫調節(jié)因子 B7 共刺激分子。因此，認為 hUCMSCs 在組織工程骨制備過程中同時具有種子細胞和細胞因子的特性，將是增強組織工程骨移植物生物活性的一種有希望的選擇。大量研究還表明，hUCMSCs 具有優(yōu)異的成骨特性，是適合骨組織工程的種子細胞。鑒于一些研究認為 hUCMSCs 的成骨能力弱于 hBMSCs，因此提高 hUCMSCs 的成骨能力是值得的。
目前有研究已經(jīng)提出了骨原細胞（干細胞、成骨細胞等）和血管生成細胞（內皮祖細胞、內皮細胞等）的共培養(yǎng)系統(tǒng)，已被證實具有促進成骨和血管生成的協(xié)同作用，有利于支架中成骨細胞的存活和預后，從而確保組織工程骨的成功骨化。然而，內皮祖細胞和內皮細胞的體外培養(yǎng)困難，分離的細胞數(shù)量非常少，增殖能力有限。此外，在共培養(yǎng)這兩種細胞的臨床應用中，不同的細胞來源會增加免疫排斥和疾病傳播的風險。因此，為降低上述風險，應使用一種來源豐富的單一 MSCs 分別分化為成骨細胞和內皮細胞，然后再進行共培養(yǎng)。迄今為止，關于單一類型干細胞的雙向分化的研究很少。
研究表明，兩種細胞的混合比例以及用于共培養(yǎng)的培養(yǎng)基直接影響成骨的結果。大多數(shù)研究人員更喜歡采用兩種細胞按1:1混合的方法，在成骨誘導培養(yǎng)基或共培養(yǎng)培養(yǎng)基（50% 成骨誘導培養(yǎng)基和 50% 內皮生長培養(yǎng)基）中培養(yǎng)。迄今為止，還沒有關于 hUCMSCs 雙向分化的培養(yǎng)條件的詳細報道。
廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院、云南省第一人民醫(yī)院口腔科、荷蘭阿姆斯特丹牙科學術中心等聯(lián)合團隊的一項研究將 hUCMSCs 預誘導分化為成骨細胞和內皮細胞，然后在篩選的培養(yǎng)基中以不同比例共培養(yǎng)。通過比較不同比例的誘導細胞在 3D 打印磷酸三鈣（TCP）支架上制備的組織工程骨移植物與顱骨臨界骨缺損的修復效果，探討并分析了預誘導 hUCMSCs 雙向分化的共培養(yǎng)細胞的成骨效果，為 hUCMSCs 在骨組織工程中的應用提供了一種先進的方法。
目前有研究已經(jīng)提出了骨原細胞（干細胞、成骨細胞等）和血管生成細胞（內皮祖細胞、內皮細胞等）的共培養(yǎng)系統(tǒng)，已被證實具有促進成骨和血管生成的協(xié)同作用，有利于支架中成骨細胞的存活和預后，從而確保組織工程骨的成功骨化。然而，內皮祖細胞和內皮細胞的體外培養(yǎng)困難，分離的細胞數(shù)量非常少，增殖能力有限。此外，在共培養(yǎng)這兩種細胞的臨床應用中，不同的細胞來源會增加免疫排斥和疾病傳播的風險。因此，為降低上述風險，應使用一種來源豐富的單一 MSCs 分別分化為成骨細胞和內皮細胞，然后再進行共培養(yǎng)。迄今為止，關于單一類型干細胞的雙向分化的研究很少。
研究表明，兩種細胞的混合比例以及用于共培養(yǎng)的培養(yǎng)基直接影響成骨的結果。大多數(shù)研究人員更喜歡采用兩種細胞按1:1混合的方法，在成骨誘導培養(yǎng)基或共培養(yǎng)培養(yǎng)基（50% 成骨誘導培養(yǎng)基和 50% 內皮生長培養(yǎng)基）中培養(yǎng)。迄今為止，還沒有關于 hUCMSCs 雙向分化的培養(yǎng)條件的詳細報道。
廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院、云南省第一人民醫(yī)院口腔科、荷蘭阿姆斯特丹牙科學術中心等聯(lián)合團隊的一項研究將 hUCMSCs 預誘導分化為成骨細胞和內皮細胞，然后在篩選的培養(yǎng)基中以不同比例共培養(yǎng)。通過比較不同比例的誘導細胞在 3D 打印磷酸三鈣（TCP）支架上制備的組織工程骨移植物與顱骨臨界骨缺損的修復效果，探討并分析了預誘導 hUCMSCs 雙向分化的共培養(yǎng)細胞的成骨效果，為 hUCMSCs 在骨組織工程中的應用提供了一種先進的方法。
hUCMSCs 的成骨分化
為了評估 hUCMSCs 的成骨分化能力，進行了 ALP 活性定量和定性分析、成骨相關基因的表達和礦化結節(jié)的研究。成骨誘導4、7、10天后，成骨培養(yǎng)基（OM）中 hUCMSCs 的 ALP 染色呈紫色，比增殖培養(yǎng)基（PM）中的顏色更深，第 4 天觀察到的顏色最深（圖1 A），這與 ALP 活性定量檢測一致（圖1 B），表明觀察期內 OM 中 ALP 活性明顯高于 PM，并在第 4 天達到最高水平，分別是第 7 天和第 10 天的兩倍和三倍。同時，成骨誘導后各檢測時間點 ALP 和 OPN 的 mRNA 表達均顯著升高，并隨時間逐漸升高，而 RUNX2 和 COL1 基因的表達僅在第 4 天顯著升高（圖1 C ）。ARS 誘導后第 3 周出現(xiàn)散在性鈣結節(jié)，5 周后出現(xiàn)斑塊。PM 組未發(fā)現(xiàn)鈣結節(jié)（圖1 D）。
圖1 hUCMSCs 的成骨分化。
（A）非誘導和成骨誘導的 hUCMSCs 的 ALP 染色 4、7 和 10 天和（B）ALP 定量分析。
（C）成骨相關基因 ALP、RUNX2、COL1、OPN 在誘導 4、7、10 d后的表達。
（D）非誘導和成骨誘導的 hUCMSCs 的 ARS 持續(xù)3 周和 5 周。第 5 周在 OM 中觀察到更多的紅色沉積物。
hUCMSCs 的內皮分化
內皮細胞誘導培養(yǎng)基（EIM）誘導三天后，hUCMSCs 變得細長，呈多邊形，具有大量血管樣結構。由于基質膠上的管形成和 ac-LDL 吞噬作用是確定誘導的 MSCs 是否具有內皮細胞功能的兩個代表性實驗，因此通過這兩個測試檢查了形態(tài)和功能的變化。研究表明，4 天的預誘導 hUCMSCs 在基質膠上接種 2.5 小時后，可以形成類似血管的網(wǎng)狀結構，而正常的 hUCMSCs 呈簇狀分布。同樣，預誘導的 hUCMSCs 可以吞噬 Dil-ac-LDL，在藍色細胞核周圍發(fā)現(xiàn)紅色熒光標記的 ac-LDL，而非誘導的 MSCs 不具有相同的功能。免疫熒光染色顯示細胞誘導后呈圓形連接，在細胞質中表達動脈內皮細胞標記物 EphrinB2 和靜脈內皮細胞標記物 EphB4。QRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，誘導后第 4、7、10 天血管生成基因 EFNB2、EPHB4、VEGF、bFGF 表達增強，第 4 天 EFNB2、VEGF、bFGF 表達增強。所有測試的基因表達在第 7 天和第 10 天顯著下降。相比之下，除了抗血管生成基因 SPROUTY1 的表達顯著下降外，SERPINF1 和 ANGPTL1 的表達在整個期間增加，與 EFNB2、VEGF 和 bFGF 的表達相反。
共培養(yǎng)培養(yǎng)基的篩選
當預誘導的 os-hUCMSCs 和 en-hUCMSCs 共培養(yǎng) 17 天時，ARS 顯示在 PM 中以 3:1、2:2 和 1:3 的比例共培養(yǎng)的細胞也具有成骨分化能力，并可形成鈣結節(jié)，與陽性對照組無統(tǒng)計學差異。同樣，PM、OM、EMM（合成基礎培養(yǎng)基，OM/EIM）（2:2）組與對照組之間無顯著差異。僅在 PMM（比例混合培養(yǎng)基，OM/EIM）（3:1）培養(yǎng)基中，3:1 組形成大量散在性鈣結節(jié)，與其他組相比明顯增加，光密度（OD）值比對照組高 5 倍左右。因此，選擇 PMM（3:1）作為后續(xù)的共培養(yǎng)基。
共培養(yǎng)對 hUCMSCs 成骨和血管生成的影響
共培養(yǎng)后，3:1 組的細胞增殖率和 ALP 活性與 OM 中的 4:0 相似，為陽性對照，而 3:1 組成骨相關基因 RUNX2、ALP 的蛋白表達高于 4:0 組。2:2 和 1:3 組的增殖率在整體觀察中維持在較高的標準。從成骨相關基因和蛋白表達來看，2:2 組的 ALP、RUNX2 及其蛋白表達最高。相比之下，1:3 組在第 1 天和第 2 天的 ALP 活性與其他組相比最高, 共培養(yǎng) 3 天后 ALP 基因表達下降, RUNX2 基因及其蛋白表達仍高于 4:0 組。
血管生成分析，與 0:4 組相比，3:1 組 ANG mRNA 表達量在第 3 天最高，2:2 組 PDGFB mRNA 表達量最高，1:3 組 VEGF mRNA 表達量最高。周細胞標志物 CD146 與血管穩(wěn)定性有關，其基因和蛋白表達從 3:1 組逐漸下降到 0:4 組。
為了進一步說明共培養(yǎng)系統(tǒng)的血管生成能力，采用了基質膠管形成試驗。預誘導3天（0天）后，en-hUCMSCs 混合百分比越高，基質膠上形成的血管小管越多，呈更完整、更連續(xù)的圓形。但共培養(yǎng) 3 天后，0:4 組仍具有良好的血管生成能力，但其他組的管狀結構明顯減弱，只有少量的分支結構。
骨缺損的修復
手術后，所有大鼠均恢復良好。顯微CT顯示，術后4周，空白組缺損周邊區(qū)域的宿主骨僅長出少量新骨。通過支架植入，支架上形成的骨骼更少。當加入 os-hUCMSCs 時，許多新骨沿支架均勻生長。此外，os-hUCMSCs 與 en-hUCMSCs 的 3:1 比例可以顯著提高骨量、骨小梁數(shù)量和厚度。
為了進一步確保骨形成結果，HE 和 Masson 三色染色均被應用。從缺損區(qū)域新再生組織的大體上看，沿著宿主骨再生的少量粉紅色結締組織填充有輕微的新骨。通過支架植入，觀察到中央部分有類骨質，有少量毛細血管。通過 os-hUCMSCs 涂層支架植入，紅色染色的成熟骨在中心區(qū)域再生，沿著脫鈣 TCP 支架的多孔結構形成致密、規(guī)則的結締組織。在 3:1 組中，大量成熟骨散布在深粉色的骨腔，周圍結締組織較少。經(jīng) Masson 三色染色，3:1 組可見深紅色染色的成熟骨和淺藍色染色的膠原蛋白，而 4:0 組形成的成熟骨較少。組織學的定量研究也驗證了 3:1 組具有更大的骨誘導能力。
該研究證實，hUCMSCs 具有稍弱的成骨分化能力，可以在短時間內誘導分化成具有內皮功能的內皮樣細胞。雙向分化的 hUCMSCs 在 PM 中共培養(yǎng)成骨細胞和內皮細胞，成骨能力顯著增強。此外，在相同比例的混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，3:1 組在體外和體內均顯示出最佳的成骨能力。這種雙向預誘導 hUCMSCs 的共培養(yǎng)策略為構建具有生物活性的組織工程骨移植提供了一種新的方法，可用于臨床移植增強成骨能力。
參考文獻：Rong Q, Li S, Zhou Y, Geng Y, Liu S, Wu W, Forouzanfar T, Wu G, Zhang Z, Zhou M. A novel method to improve the osteogenesis capacity of hUCMSCs with dual-directional pre-induction under screened co-culture conditions. Cell Prolif. 2020 Feb;53(2):e12740. doi: 10.1111/cpr.12740. Epub 2019 Dec 9. PMID: 31820506; PMCID: PMC7078770.
圖片來源：圖片來源于參考文獻
文章來源：【http://www.naturethink.com/?news/223.html】
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（C）成骨相關基因 ALP、RUNX2、COL1、OPN 在誘導 4、7、10 d后的表達。
（D）非誘導和成骨誘導的 hUCMSCs 的 ARS 持續(xù)3 周和 5 周。第 5 周在 OM 中觀察到更多的紅色沉積物。
hUCMSCs 的內皮分化
內皮細胞誘導培養(yǎng)基（EIM）誘導三天后，hUCMSCs 變得細長，呈多邊形，具有大量血管樣結構。由于基質膠上的管形成和 ac-LDL 吞噬作用是確定誘導的 MSCs 是否具有內皮細胞功能的兩個代表性實驗，因此通過這兩個測試檢查了形態(tài)和功能的變化。研究表明，4 天的預誘導 hUCMSCs 在基質膠上接種 2.5 小時后，可以形成類似血管的網(wǎng)狀結構，而正常的 hUCMSCs 呈簇狀分布。同樣，預誘導的 hUCMSCs 可以吞噬 Dil-ac-LDL，在藍色細胞核周圍發(fā)現(xiàn)紅色熒光標記的 ac-LDL，而非誘導的 MSCs 不具有相同的功能。免疫熒光染色顯示細胞誘導后呈圓形連接，在細胞質中表達動脈內皮細胞標記物 EphrinB2 和靜脈內皮細胞標記物 EphB4。QRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，誘導后第 4、7、10 天血管生成基因 EFNB2、EPHB4、VEGF、bFGF 表達增強，第 4 天 EFNB2、VEGF、bFGF 表達增強。所有測試的基因表達在第 7 天和第 10 天顯著下降。相比之下，除了抗血管生成基因 SPROUTY1 的表達顯著下降外，SERPINF1 和 ANGPTL1 的表達在整個期間增加，與 EFNB2、VEGF 和 bFGF 的表達相反。
共培養(yǎng)培養(yǎng)基的篩選
當預誘導的 os-hUCMSCs 和 en-hUCMSCs 共培養(yǎng) 17 天時，ARS 顯示在 PM 中以 3:1、2:2 和 1:3 的比例共培養(yǎng)的細胞也具有成骨分化能力，并可形成鈣結節(jié)，與陽性對照組無統(tǒng)計學差異。同樣，PM、OM、EMM（合成基礎培養(yǎng)基，OM/EIM）（2:2）組與對照組之間無顯著差異。僅在 PMM（比例混合培養(yǎng)基，OM/EIM）（3:1）培養(yǎng)基中，3:1 組形成大量散在性鈣結節(jié)，與其他組相比明顯增加，光密度（OD）值比對照組高 5 倍左右。因此，選擇 PMM（3:1）作為后續(xù)的共培養(yǎng)基。
共培養(yǎng)對 hUCMSCs 成骨和血管生成的影響
共培養(yǎng)后，3:1 組的細胞增殖率和 ALP 活性與 OM 中的 4:0 相似，為陽性對照，而 3:1 組成骨相關基因 RUNX2、ALP 的蛋白表達高于 4:0 組。2:2 和 1:3 組的增殖率在整體觀察中維持在較高的標準。從成骨相關基因和蛋白表達來看，2:2 組的 ALP、RUNX2 及其蛋白表達最高。相比之下，1:3 組在第 1 天和第 2 天的 ALP 活性與其他組相比最高, 共培養(yǎng) 3 天后 ALP 基因表達下降, RUNX2 基因及其蛋白表達仍高于 4:0 組。
血管生成分析，與 0:4 組相比，3:1 組 ANG mRNA 表達量在第 3 天最高，2:2 組 PDGFB mRNA 表達量最高，1:3 組 VEGF mRNA 表達量最高。周細胞標志物 CD146 與血管穩(wěn)定性有關，其基因和蛋白表達從 3:1 組逐漸下降到 0:4 組。
為了進一步說明共培養(yǎng)系統(tǒng)的血管生成能力，采用了基質膠管形成試驗。預誘導3天（0天）后，en-hUCMSCs 混合百分比越高，基質膠上形成的血管小管越多，呈更完整、更連續(xù)的圓形。但共培養(yǎng) 3 天后，0:4 組仍具有良好的血管生成能力，但其他組的管狀結構明顯減弱，只有少量的分支結構。
骨缺損的修復
手術后，所有大鼠均恢復良好。顯微CT顯示，術后4周，空白組缺損周邊區(qū)域的宿主骨僅長出少量新骨。通過支架植入，支架上形成的骨骼更少。當加入 os-hUCMSCs 時，許多新骨沿支架均勻生長。此外，os-hUCMSCs 與 en-hUCMSCs 的 3:1 比例可以顯著提高骨量、骨小梁數(shù)量和厚度。
為了進一步確保骨形成結果，HE 和 Masson 三色染色均被應用。從缺損區(qū)域新再生組織的大體上看，沿著宿主骨再生的少量粉紅色結締組織填充有輕微的新骨。通過支架植入，觀察到中央部分有類骨質，有少量毛細血管。通過 os-hUCMSCs 涂層支架植入，紅色染色的成熟骨在中心區(qū)域再生，沿著脫鈣 TCP 支架的多孔結構形成致密、規(guī)則的結締組織。在 3:1 組中，大量成熟骨散布在深粉色的骨腔，周圍結締組織較少。經(jīng) Masson 三色染色，3:1 組可見深紅色染色的成熟骨和淺藍色染色的膠原蛋白，而 4:0 組形成的成熟骨較少。組織學的定量研究也驗證了 3:1 組具有更大的骨誘導能力。
該研究證實，hUCMSCs 具有稍弱的成骨分化能力，可以在短時間內誘導分化成具有內皮功能的內皮樣細胞。雙向分化的 hUCMSCs 在 PM 中共培養(yǎng)成骨細胞和內皮細胞，成骨能力顯著增強。此外，在相同比例的混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，3:1 組在體外和體內均顯示出最佳的成骨能力。這種雙向預誘導 hUCMSCs 的共培養(yǎng)策略為構建具有生物活性的組織工程骨移植提供了一種新的方法，可用于臨床移植增強成骨能力。
參考文獻：Rong Q, Li S, Zhou Y, Geng Y, Liu S, Wu W, Forouzanfar T, Wu G, Zhang Z, Zhou M. A novel method to improve the osteogenesis capacity of hUCMSCs with dual-directional pre-induction under screened co-culture conditions. Cell Prolif. 2020 Feb;53(2):e12740. doi: 10.1111/cpr.12740. Epub 2019 Dec 9. PMID: 31820506; PMCID: PMC7078770.
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文章來源：【http://www.naturethink.com/?news/223.html】
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