CAR-T是當(dāng)下最受關(guān)注的血液腫瘤細(xì)胞療法，如何高效、快速、安全地制備CAR-T細(xì)胞，是急待解決的技術(shù)瓶頸之一。目前開(kāi)發(fā)一種高效、快速、多功能和安全的基因工具來(lái)構(gòu)建重組T細(xì)胞的需求日益迫切，mRNA-CAR被認(rèn)為是一種快速安全，低成本的解決方案。但通過(guò)mRNA轉(zhuǎn)染的CAR基因工程雖然能克服載體風(fēng)險(xiǎn)，但只能提供瞬時(shí)表達(dá)。德國(guó)癌癥研究中心的科學(xué)家們開(kāi)發(fā)了這種安全快速且持久表達(dá)的、非病毒非整合型的DNA載體平臺(tái)、能夠在臨床規(guī)模的封閉體系中快速制備CAR-T細(xì)胞。
 

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作者首先選擇了一個(gè)DNA載體pEPI，去除了非必需元件，將載體從3kb縮小到1.5kb。第一輪改造得到一個(gè)功能提高、能在HEK  293T和 HeLa細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的載體 pS/MARt。然后通過(guò)引入剪切位點(diǎn)去掉了來(lái)自S/MAR非必需的序列和ARE，獲得了更穩(wěn)定的SP-nS/MARt-B 載體。研究人員再用來(lái)自載脂蛋白apolipoprotein B (ApoB)的更緊湊形式S/MAR替換了IFN-β S/MAR，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)最后版本的SP-nS/MARt-A 納米載體是最佳的，不但轉(zhuǎn)染效率最高，產(chǎn)生克隆最多，GFP表達(dá)最強(qiáng)（轉(zhuǎn)染24小時(shí)后）。這還沒(méi)完，研究人員用來(lái)自人EF1α 啟動(dòng)子替換掉了CMV啟動(dòng)子，把最后一點(diǎn)病毒序列也去掉了。在Jurkat76 (J76) 細(xì)胞中證實(shí)，新載體能持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，80%的活細(xì)胞都能表達(dá)報(bào)告基因。更強(qiáng)的是，研究人員分離出表達(dá)GFP的細(xì)胞，培養(yǎng)360天后依然能檢測(cè)到GFP穩(wěn)定表達(dá)，每個(gè)細(xì)胞有1.71個(gè)游離性拷貝，超長(zhǎng)待機(jī)，還不會(huì)整合到染色體上。轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯區(qū)別，表明載體對(duì)細(xì)胞毒性影響很小，也不會(huì)改變CD4和CD8比例。用pEPI載體對(duì)照轉(zhuǎn)染27天后GFP幾乎都消失而SP-nS/MARt-A轉(zhuǎn)染的仍有40%具有GFP表達(dá)。這些都表明，新載體用于制備CAR-T細(xì)胞應(yīng)該非常有優(yōu)勢(shì)。
 

在三種異種移植小鼠模型中對(duì)新載體進(jìn)行驗(yàn)證

參考文獻(xiàn)：Bozza M, De Roia A, Correia M P, et al. A nonviral, nonintegrating DNA nanovector platform for the safe, rapid, and persistent manufacture of recombinant T cells[J]. Science advances, 2021, 7(16): eabf1333.