由異體細(xì)胞組成的多層皮膚替代品已被測(cè)試用于治療不愈合的皮膚潰瘍。然而，這種非天然皮膚移植不能永久移植，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈��?duì)與宿主組織整合重要的皮膚血管網(wǎng)絡(luò)。在這項(xiàng)研究中，我們描述了使用三維生物打印技術(shù)制造一種可植入的多層血管化生物工程皮膚移植物。移植物是使用一個(gè)生物墨水包含人類包皮皮膚成纖維細(xì)胞(FBs)，人類內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)來自臍帶血人類內(nèi)皮細(xì)胞群體形成細(xì)胞(HECFCs)，和人類胎盤周細(xì)胞(PCs)懸浮在老鼠尾巴I型膠原蛋白形成真皮然后打印第二個(gè)生物墨水包含人類包皮角質(zhì)形成細(xì)胞(KCs)形成一個(gè)表皮。在體外， KCs復(fù)制和成熟形成多層屏障，而ECs和pc自組裝成相互連接的微血管網(wǎng)絡(luò)。真皮生物墨水中的pc與ec內(nèi)襯的血管結(jié)構(gòu)相關(guān)，似乎能促進(jìn)KC的成熟。當(dāng)這些3D打印的移植物被植入免疫缺陷小鼠的背側(cè)時(shí)，人ec內(nèi)襯結(jié)構(gòu)與從傷口床上產(chǎn)生的小鼠微血管一起接種，并在植入后4周內(nèi)灌注。打印真皮中pc的存在增強(qiáng)了宿主微血管對(duì)移植物的侵襲和表皮網(wǎng)的形成。

關(guān)鍵詞：皮膚，組織工程，生物打印，再生醫(yī)學(xué)，微血管系統(tǒng)

影響聲明
三維打印可用于生成多層帶血管化的人體皮膚移植，這可能會(huì)克服目前在無血管皮膚替代品中觀察到  的移植物存活的限制。在皮膚生物墨水中包含人周細(xì)胞似乎可以促進(jìn)皮膚和表皮的成熟

引言
他綜合了美國(guó)由于靜脈淤積、糖尿病或壓力引 起皮膚潰瘍的年發(fā)病率估計(jì)有700萬人嗎1并將隨之增 加預(yù)期壽命不斷延長(zhǎng)，糖尿病的患病率也在不斷增加。易感患者的傷口愈合能力往往受損。不能愈合的皮膚傷口可直接導(dǎo)致殘疾，并作為局部和全身感染并發(fā)癥的門戶。2目前的治療方法包括這兩種局部傷口治療/敷料和植皮。3自體皮膚移植雖然有效，但在收獲部位產(chǎn)生新的傷口，這些人的愈合也很差。4,5異體皮膚可以提供傷口閉合，但會(huì)引發(fā)患者免疫系統(tǒng)的強(qiáng)烈排斥。6組織工程多層皮膚移植物，如阿普利格拉夫™， 是第三種治療選擇。Apligraf是一種工程雙層結(jié)構(gòu)，包含含有人角質(zhì)形成細(xì)胞(KCs)的表皮和含有新生兒包皮成纖維細(xì)胞(FBs)的真皮。7FDA批準(zhǔn)的臨床經(jīng)驗(yàn)和基礎(chǔ)是，Apligraf作為一種促進(jìn)愈合的生長(zhǎng)因子的來源。7–9 然而， 它在幾周內(nèi)就下跌了。有趣的是，盡管Apligraf的細(xì)胞成分與宿主是異體的，但移植物的丟失似乎并不是對(duì)這些細(xì)胞的免疫介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，也不會(huì)使受體的免疫系統(tǒng)對(duì)它們敏感。

值得注意的是，Apligraf和其他已批準(zhǔn)的雙層皮膚替代品缺乏皮膚血管系統(tǒng)，從而阻止了長(zhǎng)期穩(wěn)定的移植。我們對(duì)真皮再細(xì)胞化的經(jīng)驗(yàn)表明，將真皮血管系統(tǒng)設(shè)計(jì)成雙層皮膚替代品將促進(jìn)這些移植物的穩(wěn)定整合。10此外，人類血管細(xì)胞可以提供促進(jìn)愈合和組織成熟的血管分泌因子。11,12在過去的十年里，組織工程的一個(gè)重大進(jìn)展是三維生物打印的出現(xiàn)，這是一種針對(duì)非生物系統(tǒng)開發(fā)的工具的改編，使在多個(gè)相關(guān)長(zhǎng)度尺度上精確制造生物系統(tǒng)成為可能。13–15人類皮膚中存在的皮膚微血管系統(tǒng)和其他三維結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，很難通過簡(jiǎn)單的手工制造方法在體外復(fù)制。

生物打印方法，如噴墨、微擠出和激光輔助打印，目前正在探索開發(fā)更復(fù)雜的合成皮膚模型。16–19 最近，黃等人。使用3D生物打印平臺(tái)作為工具，以促進(jìn)汗腺細(xì)胞的分化和再生。15作者證明了一種基于明膠和海藻酸鹽的支架可以創(chuàng)造一個(gè)能夠誘導(dǎo)表皮祖細(xì)胞分化為汗腺細(xì)胞的環(huán)境。此外，將基質(zhì)直接印在小鼠燒傷傷口上，可誘導(dǎo)汗腺再生。20將產(chǎn)生色素的黑素細(xì)胞和免疫細(xì)胞的結(jié)合在印刷的皮膚結(jié)構(gòu)也有報(bào)道。21–23其他使用三維生物打印技術(shù)的方法已經(jīng)證明可以在體外成功地生成可灌注的毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)。24,25 盡管取得了這些進(jìn)展，但在體外，具有生理相關(guān)維度的功能內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)的生成仍存在主要的局限性。據(jù)我們所知，據(jù)報(bào)道的皮膚結(jié)構(gòu)中3D生物打印灌注血管的最小直徑為80毫米。26這種大小明顯大于皮膚微血管中的毛細(xì)血管( 淺表水平叢<26mm ， 真皮- 皮下叢<50mm)。27,28我們之前已經(jīng)證明了使用三維生物打印來制造皮膚等效物的可行性。29然而，這種生物打印的皮膚組織缺乏完全成熟的角質(zhì)層和有血管化的真皮層。在這項(xiàng)研究中，我們展示了使用人類細(xì)胞和3D打印技術(shù)制造多層、血管化的皮膚結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在免疫缺陷小鼠植入后通過移植物和宿主微血管灌注。

材料和方法
細(xì)胞分離、培養(yǎng)、表型和調(diào)節(jié)
根據(jù)賓夕法尼亞大學(xué)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)的協(xié)議，用新鮮丟棄的人包皮中培養(yǎng)的人皮膚纖維纖維和KCs進(jìn)行了初步的體外實(shí)驗(yàn)。隨后的實(shí)驗(yàn)使用了根據(jù)耶魯大學(xué)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)的協(xié)議，在耶魯大學(xué)獲得的新鮮丟棄的人類包皮。根據(jù)先前發(fā)表的方案，從包皮樣本中分離出FBs和KCs。30從真皮獲得的FBs和從表皮獲得的KCs分別在杜爾貝科改良的鷹培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)，分別添加10% 胎 牛 血 清 （ 亞 特 蘭 大 生 物 制 劑 ） 、1%Pen/Strep(Gibco)和KGM金培養(yǎng)基（龍沙）。人內(nèi)皮細(xì)胞(ECs) 從臍帶血人內(nèi)皮集落形成細(xì)胞(HECFCs) 在EGM2 培養(yǎng)基(Lonza) 中培養(yǎng)。31 周細(xì)胞(PCs)在添加20%胎牛血清和1%Pen/Strep的M199培養(yǎng)基(Gibco)中分離培養(yǎng)。32熒光流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)， 培養(yǎng)的真皮FBs均表達(dá)PDGFR-a、PDGFR-b和CD90，但不表達(dá)NG2(pc的標(biāo)記物)、CD31(ECs的標(biāo)記物)或CD45（造血細(xì)胞的標(biāo)記物）。此外，免疫熒光顯微鏡證實(shí)了a-平滑肌肌動(dòng)蛋白的陽(yáng)性染色(圖1a)，提示本研究中使用的培養(yǎng)的真皮FBs顯示了肌成纖維細(xì)胞樣表型。33,34 熒光流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)人胎盤pc表達(dá)NG2、CD90和PDGFR-b， 但缺乏PDGFR-a、CD31 和CD45( 圖。而HECFC 衍生的ECs 表達(dá)CD31 ， 而不表達(dá)CD45( 圖1c)。為了在體外實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)的長(zhǎng)期活細(xì)胞可視化，根據(jù)制造商的說明（基因聲典），用表達(dá)RFP 的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)ECs 。所有細(xì)胞均保持在37°C 和5%CO條件下₂直到打印。

真皮和表皮生物墨水的制備
真皮和表皮生物墨水是根據(jù)前面描述的方案設(shè)計(jì)的。35. 以人包皮為參考，初步實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了KCs和FBs的比例。與人類包皮相比，基底上和基底層厚度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的條件被用于生成包含F(xiàn)Bs 和KCs的3D結(jié)構(gòu)。與人類包皮相比，基底上和基底層厚度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的條件被用于生成包含F(xiàn)Bs和KCs的3D結(jié)構(gòu)。在體外，打印構(gòu)建物的真皮室中PCs和ECs與FBs的比例也進(jìn)行了優(yōu)化。我們選擇在血管內(nèi)皮穩(wěn)定自組裝而不退化的條件，以及在體外添加最多數(shù)量的PCs而不引起膠原收縮的條件，制造由KCs、FBs、ECs和pc組成的3D打印結(jié)構(gòu)。真皮生物墨水的配方為7.0·105/mL 人類FBs 和，在哪里表示，7.0·105/mL人類ECs，含或不含3.5·105/mL 個(gè)人PCs ， 懸浮在一種溶液中， 包括2.2mL3.5mg/mL 大鼠尾I 型膠原蛋白（ 康寧） ，150mL 胎 牛 血 清 （ 亞 特 蘭 大 生 物 制 劑 ） ，290mL10XpH   重 組 緩 沖 液 (0.05M    NaOH  ，2.2%NaHCO₃ ， 200mMHEPES) ， 290mL10·HAM-F12。

圖1. 培養(yǎng)的人皮膚FBs、胎盤PCs和ECFC來源的ECs的免疫特性和表型。

（A） 免疫熒光顯微鏡證實(shí)，真皮FBs表達(dá)A-平滑肌肌動(dòng)蛋白、PDGFR-A、PDGFR-b和CD90，但不表達(dá)NG2。胎盤PC的a-平滑肌肌動(dòng)蛋白、PDGFR-b、NG2和CD90染色陽(yáng)性，但PDGFR-a染色陰性。（b）真皮FBs的流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)了PDGFR-a、PDGFR-b和CD90 的表達(dá)。此外，這些細(xì)胞缺乏NG2、CD31和CD45 的表達(dá)。如流式細(xì)胞術(shù)所證實(shí)，PCs顯示PDGFR-b、NG2和CD90 的陽(yáng)性表達(dá)，但缺乏PDGFR-a、CD31和CD45的表達(dá)。（C） 免疫熒光顯微鏡下，人ECFC衍生的ECs對(duì)VE鈣粘蛋白呈陽(yáng)性染色，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示CD31呈陽(yáng)性表達(dá)，但對(duì)CD45無陽(yáng)性表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)的特異性染色顯示為綠色；同型匹  配對(duì)照染色顯示為紅色。在來自不同供體的三個(gè)獨(dú)立隔離中觀察到類似結(jié)果。比例尺：100毫米。FB，  成纖維細(xì)胞；周細(xì)胞；內(nèi)皮集落形成細(xì)胞。彩色圖像可在網(wǎng)上獲得。

表皮生物墨水的配方為2·106/mL人KCs在500mL的1：1KGM和皮膚分化培養(yǎng)基中[DMEM/HAM的F-12（ 3 ： 1 ） 添加10% 胎牛血清， 0.1nM 霍亂毒素(Sigma)， 5mg/mL胰島素(Sigma)， 5mg/mL載脂蛋白 轉(zhuǎn) 鐵 蛋 白 (Sigma) ， 0.4mg/mL 氫 化 可 的 松 – 21(Sigma)和0.5ng/mL表皮生長(zhǎng)因子(Peprotech)]。

皮  膚  等  效  物  的  三  維  生  物  打  印
利用先前描述的打印平臺(tái)進(jìn)行了改善表皮分化的初步實(shí)驗(yàn)。36,37皮膚結(jié)構(gòu)是通過打印含有FBs的冷(4°C)真皮生物墨水(從3mL注射器分配)，分辨率為300毫米，氣壓為6psi，在3毫米孔徑的6孔PET插入物上生成的。 在 37°C 下真皮層膠化后， 以300mm的分辨率和2.5psi的500mL打印含有KCs的表皮生物墨水。打印后，1mL的表皮生物墨水沒有KCs被添加到6孔Transwell插入物的底部腔室中。在37°C下孵育24小時(shí)后，移除Transwell插入物頂部和底部的培養(yǎng)基，改為100%皮膚分化培養(yǎng)基， 如前所述。在介質(zhì)浸泡4天后，將含有皮膚等效物的Transwell插入物小心地轉(zhuǎn)移到氣液界面(ALI)， 放置在獵鷹中的100mm孔細(xì)胞過濾器上®六井深井板（康寧）。取出頂部的培養(yǎng)基，在細(xì)胞濾器底部加入9mL皮膚分化培養(yǎng)基，制作確保沒有氣泡被困在特蘭斯韋爾插入物下面。細(xì)胞濾清器下面的培養(yǎng)基每3天更換一次，連續(xù)2周。

血管化的皮膚移植是使用市售的生物打印機(jī)
（細(xì)胞墨水）制作的。一種可更換的打印頭，包括一個(gè)無菌的 30 號(hào)不銹鋼鈍針頭（ 內(nèi)部： 0.15mm，外部：0.31毫米；在50kPa的4°C擠壓壓力下打印皮膚生物墨水205 秒.生物打印構(gòu)建物浸在EGM2培養(yǎng)基4天，每天更換培養(yǎng)基，使內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)自我組裝。第4天，無菌32號(hào)不銹鋼鈍針（內(nèi)部： 0.10mm ， 外部： 0.24 毫米； 在35kPa 的擠壓壓力下，使用墨水打印表皮生物墨水54s。24小時(shí)后，將打印出來的培養(yǎng)物浸泡在100%的皮膚培養(yǎng)基中，再浸泡4天，隨后在小鼠身上縫合。

生物打印移植物的形態(tài)學(xué)特征
為了優(yōu)化最小化真皮和表皮隔間混合的條件， 根據(jù)制造商的說明，根據(jù)制造商的說明，分別用™ 紅色CMPTX和綠色CMFDA染料對(duì)70%的真皮FBs和KCs進(jìn)行熒光標(biāo)記。打印后3天，在尼康EclipseTi-E 倒置熒光顯微鏡（尼康儀器）上使用電動(dòng)平臺(tái)進(jìn)行成像，并獲得多個(gè)z-堆棧圖像，以評(píng)估打印構(gòu)建物中FBs和KCs的空間分布。圖像用nis-elents軟件（尼康儀器）進(jìn)行處理，生成每個(gè)樣本的三維投影。

冷凍切片(7mm)通過H&E、免疫熒光和免疫組化染色進(jìn)行分析。為了進(jìn)行免疫熒光分析，組織切片在冷丙酮中浸泡10min，然后用10%正常山羊血清PBS或10%驢血清封閉1小時(shí)。然后在4°C潮濕的室內(nèi)孵育過夜，與抗細(xì)胞角蛋白10(兔，1：200， 克隆EP1607IHCY ； Abcam) 、細(xì)胞角蛋白14 （ 小鼠， 1 ： 200 ， 克隆LL002 ； Abcam ）、聚絲蛋白（小鼠，1：200，克隆FLG/1561；Abcam)、膠原蛋白(小鼠；1：200，克隆COL-94；Abcam）、層粘連蛋白5 、兔， 1 ：200 ，克隆SP6)、人類CD31（小鼠，1：200，小鼠F4/80(大鼠，1：50，克隆BM8；生物科學(xué)™)，熒光素凝集素I分離素B₄（gsl- ib₄；1：200；載體實(shí)驗(yàn)室），或熒光素真核桿菌凝集素I（UEA-1；1：200；載體實(shí)驗(yàn)室）。然后用PBS （ 3· ） 清洗載玻片， 與抗小鼠或抗兔Fluor™488 或AlexaFlaFluor™48Fluor568( 山羊， 1 ： 500；H&L二抗在室溫下孵育1小時(shí)。載玻片用含有DAPI（矢量實(shí)驗(yàn)室）的載體抗褪色安裝介質(zhì)進(jìn)行核染色， 并在尼康EclipseTi-E倒置熒光顯微鏡（尼康儀器）上成像。免疫組化分析采用以下生物素-sp親和力純IgG(H+L)抗體：驢抗兔IgG(H+L)， 驢抗小鼠IgG(H+L)，山羊抗大鼠。二抗的底物包含在載體染色的ABC過氧化物酶試劑盒和AEC過氧化物酶底物試劑盒中

SCID/bg小鼠有血管化的皮膚
所有程序都按照耶魯大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的協(xié)議進(jìn)行。在無菌條件下，將打印的皮膚結(jié)構(gòu)移植到6-12周齡女性的側(cè)面C.B-17SCID/bg 小鼠(Taconic 農(nóng)場(chǎng)， 日耳曼敦， 紐約)，腹腔注射氯胺酮/噻嗪麻醉。從動(dòng)物背側(cè)切除小鼠皮膚（直徑*2），在傷口上放置一塊相當(dāng)大小的打印皮膚，用6-0Prolene縫合線縫合。然后用兩層凡士林紗布覆蓋，預(yù)涂白曲肽乳膏，一層泰加德姆， 兩層覆蓋傷口大小的繃帶， 最后用Coban3M膠帶包裹。植入后10天去除繃帶。

尾靜脈注射熒光素UEA-I評(píng)價(jià)體內(nèi)灌注
熒光素UEAI（載體實(shí)驗(yàn)室）與鹽鹽水以1：1的比例稀釋。每只小鼠通過尾靜脈注射200微升，并在收獲移植物前循環(huán)30min。對(duì)小鼠實(shí)施安樂死， 收獲移植物并切成兩半：一半用10%緩沖福爾馬林固定過夜進(jìn)行石蠟包埋；另一半用OCT包埋，冷凍，冷凍切片(7mm厚)。

結(jié)果
生物打印皮膚移植物的不同表皮/真皮隔室的 產(chǎn)生和特征
為了能夠打印多層3D皮膚結(jié)構(gòu)，我們之前使用了NaHCO霧化交聯(lián)膠原蛋白。29在這個(gè)模型中， 依次沉積了8層膠原蛋白前體。在每一層膠原蛋白和FBs之間，霧化NaHCO₃作為交聯(lián)劑應(yīng)用。我們測(cè)試了這種凝膠化方法，以制造一種由人原代細(xì)胞組成的帶血管化的皮膚移植物，并將霧化時(shí)間從5 秒到10秒不等。然而，霧化并不能促進(jìn)FBs在真皮內(nèi)的均勻分布，并支持KC的分化(圖。2A).當(dāng)膠原層霧化5s時(shí)，真皮FBs沉積在Transwell插入物的底部，而霧化10s產(chǎn)生條紋狀圖案，F(xiàn)Bs層之間有明顯的分離。

與這些觀察結(jié)果一致的是，第20天打印結(jié)構(gòu)的組織學(xué)分析顯示，膠原層霧化5s時(shí)，在Transwell 插入膜附近聚集，而霧化10s導(dǎo)致膠原和FBs層的空間分離。兩種情況下都沒有或表皮分化差。為了解決這個(gè)問題，我們開發(fā)了一種膠原聯(lián)方法， 在打印前將細(xì)胞與pH重組緩沖液混合，隨后孵育皮膚分化培養(yǎng)基中的37°C(圖2B)。

從第4天開始，在ALI處培養(yǎng)打印出來的皮膚結(jié)構(gòu)物。在第30天，這些生物打印結(jié)構(gòu)顯示真皮內(nèi)FBs 的分布顯著改善，隨后打印的表皮室的形態(tài)得到改善(圖2C)，聚絲蛋白（角質(zhì)層的標(biāo)記物）、CK14（基底層的標(biāo)記物）、CK10（基上層的標(biāo)記物） 和IV型膠原（ 基底膜的標(biāo)記物） 的表皮染色陽(yáng)性，類似于人類皮膚。此外，所產(chǎn)生的上皮細(xì)胞有組織良好的立方體基底細(xì)胞粘附在基底膜上， 這表明了一個(gè)成熟的皮膚組織的發(fā)育。

圖2 .生物打印皮膚構(gòu)建物的皮膚/表皮隔間的優(yōu)化、成熟和表征，體外。

(A)評(píng)價(jià)霧化NaHCO₃的影響.作為一種膠原交聯(lián)劑，在3D生物打印構(gòu)建物中，皮膚FBs的分布和KCs的分 化。頂部圖像顯示為打印結(jié)構(gòu)在第3天的z-堆棧熒光圖像的最大投影。FBs和KCs用細(xì)胞追蹤器進(jìn)行熒光  標(biāo)記™紅色CMPTX和細(xì)胞追蹤器綠色CMFDA染料。底部圖像顯示打印后20天的生物打印結(jié)構(gòu)的H&E染色  顯示，當(dāng)膠原層被霧化時(shí)，F(xiàn)Bs的分布不均勻。比例尺：100mm。(B)示意圖顯示了人體皮膚等效物的  分層生物打印。(C)在體外成熟30天后，人包皮和生物打印構(gòu)建物的H&E和免疫熒光染色的代表性圖  像。打印的移植物顯示聚絲蛋白、細(xì)胞角蛋白14、細(xì)胞角蛋白10和IV型膠原的陽(yáng)性表達(dá)，與人包皮相  似。細(xì)胞核用DAPI染色（藍(lán)色）。比例尺：100um。KC、角質(zhì)形成細(xì)胞。彩色圖像可以在網(wǎng)上找到。

人內(nèi)皮細(xì)胞和胎盤周細(xì)胞摻入3D生物打印皮膚移植物的真皮腔室

我們?cè)u(píng)估了HECFC來源的內(nèi)皮細(xì)胞在生物打印皮膚移植物的真皮腔室中產(chǎn)生血管樣結(jié)構(gòu)的能力。我們首先評(píng)估了皮膚分化培養(yǎng)基在體外誘導(dǎo)和/或維持內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)的能力(圖3A)。在皮膚分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)的構(gòu)建物的活體成像分析顯示，在培養(yǎng)4天期間沒有顯示內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)的形成(圖3B，方案A)。相比之下，EGM2培養(yǎng)基支持血管自組裝，但在第4天后不需要(圖3B，方案B)。

第10 天皮膚介質(zhì)的Z-stack共聚焦成像顯示開放腔的3D內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)(圖3C)，，分泌IV型膠原，這是基底膜的主要成分毛細(xì)血管內(nèi)皮，并被致密的膠原纖維包圍(補(bǔ)充影片S1)。重要的是，在隨后的皮膚分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)的50天內(nèi)，沒有觀察到血管消退的跡象(圖。3D). PCs在體內(nèi)和體外都能穩(wěn)定微血管。32,38因此， 我們將PCs加入到皮膚生物墨水中。生物打印后7 天，人類PCs與ECs內(nèi)襯的血管直接相關(guān)，而FBs仍然隨機(jī)分布在基質(zhì)中(圖。3C).為了生成用于植入的血管化雙層皮膚結(jié)構(gòu)，真皮和表皮腔室分兩個(gè)階段打印。首先，用人ECs和FBs生物打印有血管化的真皮腔室，并在EGM2中培養(yǎng)4天，以促進(jìn)血管自組裝。第二，在第4天將含有KCs的表皮腔室進(jìn)行生物打印，并在皮膚分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到移植，不暴露于ALI(圖4A)。這種兩步的方法允許在真皮和表皮的內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)的自組裝232

圖. 3.評(píng)估培養(yǎng)條件，允許內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)組裝。

培養(yǎng)條件測(cè)試的時(shí)間線：表達(dá)RFP的ECs與皮膚FBs共培養(yǎng)，在皮膚培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天(方案A)；或EGM2培養(yǎng)4天，隨后在皮膚培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到體外培養(yǎng)的第37天(方案B)。(B)活細(xì)胞熒光顯微鏡觀察  用方案A培養(yǎng)的生物打印真皮結(jié)構(gòu)，顯示沒有EC網(wǎng)絡(luò)的形成，而方案B促進(jìn)了EC網(wǎng)絡(luò)的自組裝和長(zhǎng)期維  護(hù)。比例尺：100mm。第10天，體外皮膚培養(yǎng)基中自組裝內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)的(C)三維重建。比例尺：50毫米。  網(wǎng)格定義了三維空間。(D)打印樣本隨訪50天，以評(píng)估內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)在皮膚培養(yǎng)基中的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和活力。  活細(xì)胞用鈣黃綠素（綠色）染色，細(xì)胞核用Hoechst（藍(lán)色）染色。(E)打印后7天，表達(dá)RFP的ECs、cy5-   真皮FBs和表達(dá)GFP的PCs共培養(yǎng)的實(shí)時(shí)成像。比例尺：100um。彩色圖像可以在網(wǎng)上找到。

角質(zhì)化第10天對(duì)含有ECs的皮膚移植物的免疫組化分析顯示存在人CD31+真皮內(nèi)的血管狀結(jié)構(gòu)(圖。4B).正如預(yù)期的那樣，沒有人ECs的生物打印移植物沒有對(duì)人CD31進(jìn)行染色+細(xì)胞與人類皮膚相似，所有生物打印的皮膚移植物都顯示出表皮基底層Ki67和CK14陽(yáng)性表達(dá)，提示基底KCs正常增殖。有趣的是，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中， 植皮的真皮中PCs的存在顯著增加了表皮的厚度和成熟。特別是，含有人PCs的皮膚移植物顯示出表皮基底膜的主要成分層粘連蛋白5的表達(dá)增加，以及CK10的存在+基上末端分化組織良好的CK14以上的KC+立方基底KCs。

在體外培養(yǎng)8天后，將加入和不加入人ec和pc的 生物打印皮膚移植物植入免疫缺陷小鼠的背側(cè)(圖。5A).在一項(xiàng)試點(diǎn)實(shí)驗(yàn)中，植入14天的生物打印皮膚移植物顯示出高度的出血和炎癥，與含有人類血管細(xì)胞的移植物相比，特別是在非血管化的生物打印移植物中(圖。5B).皮膚亞態(tài)用人ECs和PCs組成的管狀細(xì)胞在植入后2周包含血管結(jié)構(gòu)，細(xì)胞角蛋白10和14的表達(dá)顯示出更高程度的表皮組織，以及早期網(wǎng)脊的形成。

移植后30天，通過總蛋白染色評(píng)估人表皮的來源，總蛋白染色是人KCs終末分化的標(biāo)志(圖。6A). 免疫組化分析證實(shí)，生物打印的血管化皮膚移植物的表皮是由人KCs形成的。此外，在沒有ec的生物打印移植物中觀察到明顯的收縮。第30天生物打印移植物的組織學(xué)分析證實(shí)，與帶血管化的皮膚相比，沒有EC的生物打印移植物明顯更小，小鼠皮膚占據(jù)的面積明顯更大(圖 6B).與預(yù)期的一樣，在不包括人EC的移植物中未檢測(cè)到人ECs(圖。6C).人EC在植入后4周包含血管結(jié)構(gòu)。部分微血管用GSL-B染色的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞排列4，提示宿主血管生成。然而，許多遠(yuǎn)離傷口床的血管內(nèi)排列有人ECs(圖6c)。在移植標(biāo)記的人ECs前30min通過尾靜脈注射熒光UEA-1，確認(rèn)這些血管的灌注。含有PCs 的生物打印移植物顯示了人CD31+許多被CD31陰性細(xì)胞包圍的血管。

圖4.移植前的3D生物打印的血管化皮膚等效物的特征。(A)制造人體血管化皮膚等量物的2階段方案的時(shí)  間軸。首先，對(duì)在EGM2中培養(yǎng)4天的帶血管化的真皮室進(jìn)行生物打印，其次，對(duì)表皮室進(jìn)行生物打  印，并在皮膚培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在第8天，生物打印的構(gòu)建物被鑒定或植入到免疫缺陷小鼠模型上。(B在移植時(shí)，人類成人皮膚和生物打印構(gòu)建物的H&E和免疫熒光染色的代表性圖像。含有ec的生物打印皮膚移植物顯示人CD31+血管樣結(jié)構(gòu)，而沒有人ECs的生物打印移植物則沒有。生物打印的皮膚移植物顯示表皮基底層Ki67和CK14陽(yáng)性表達(dá)。含有人PCs的皮膚移植物顯示層粘連蛋白5和CK10的表達(dá)增加+基底上末端分化的KCs。細(xì)胞核用DAPI染色（藍(lán)色）。比例尺：50um。彩色圖像可以在網(wǎng)上找到。

在有血管化的皮膚移植物中，特別是在含有PCs 的移植物中，可以觀察到成熟的層狀表皮和網(wǎng)狀脊?fàn)罱Y(jié)構(gòu)的形成。在所有的移植物中，也可以觀察到在表皮-真皮交界處的層粘連蛋白5的表達(dá)。有趣的是，除了ECs外，含有PCs的移植物似乎能引起更廣泛的血管生成宿主反應(yīng)。所有移植物在傷口床和移植皮膚表皮的真皮和基底層均有表達(dá)F4/80的小鼠巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。相比之下，缺乏ECs 的移植物浸潤(rùn)更強(qiáng)烈。與14天的外植體相比，相關(guān)的炎癥減少，提示消退。

討論

在目前可用的雙層皮膚中缺乏血管床限制了它們作為非愈合皮膚潰瘍的永久治療的能力。在這項(xiàng)研究中，我們?cè)?D生物打印皮膚移植物的真皮層中加入了一個(gè)由人類ECs自組裝的血管床，有或沒有人類PCs。

圖 5.移植時(shí)和移植后2周在免疫缺陷小鼠上的特征。(A)移植時(shí)加入和不合并ECs和;PCs的生物打印移植物的照片。（B）的代表性圖像移植后2周，生物打印構(gòu)建物的H&E和免疫熒光染色。H&E染色顯 示，與含ECs的移植物相比，無血管化的生物打印皮膚移植物的出血程度更高。UEA-1染色顯示存在人ec內(nèi)襯的血管。網(wǎng)狀脊的形成尤其是在含PCs的帶血管化的生物打印移植物。比例尺：50um。彩色圖像可以在網(wǎng)上找到。

過去使用3D生物打印技術(shù)的方法已經(jīng)通過在體外預(yù)構(gòu)建與ECs內(nèi)襯的通道來生成毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)。24,25我們使用了另一種方法，專注于ECs的自組裝，在移植前產(chǎn)生前血管化的真皮隔室。雖然模式形成策略具有易于連接到流動(dòng)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)， 但血管模式形成通常是通過非生理設(shè)計(jì)來實(shí)現(xiàn)的，而且較小的血管直徑很難產(chǎn)生和灌注。26,39相反，當(dāng)ECs被允許自組裝成微血管時(shí)，它們形成復(fù)雜的形態(tài)，其模式類似于自然組織，管腔直徑類似于自然微血管。40,41此外，我們能夠證明我們的方法克服了與體外血管回歸和體內(nèi)灌注相關(guān)的局限性。26,42 具體來說，F(xiàn)Bs和PCs的摻入減輕了植入前的血管退化， 血管在體內(nèi)以血管分泌的方式灌注（通過宿主血管侵犯證明）和通過吻合(通過預(yù)注射Ulex染色證明)。據(jù)我們所知，3D生物打印皮膚移植物的生成和植入，包括血管化的真皮和人表皮。最近，Kim等人。使用了一種來自豬皮膚衍生的脫細(xì)胞外細(xì)胞外的生物墨水通過擠壓和噴墨打印模塊，利用Lar基質(zhì)(dECM)對(duì)免疫缺陷小鼠進(jìn)行生物打印，形成有血管化的皮膚貼片。43將人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(ASC)和HECFC來源的ec裝載入dECM生物墨水中，生成直徑1cm、厚度1mm的皮膚貼片。在ASC+EC-dECM封裝的生物打印貼片中，由于dECM的快速降解，傷口被加速閉合；通過招募宿主細(xì)胞觀察到宿主新生血管和再上皮化。14天后，宿主幾乎完全形成再上皮細(xì)胞（*初始間隙長(zhǎng)度的90%）。然而，在生物打印皮膚貼片的真皮內(nèi)存在灌注的人ECs內(nèi)襯血管沒有報(bào)道。

限制我們之前努力的一個(gè)問題是控制皮膚生物墨水中I型膠原的凝膠化。29我們通過在打印前混合pH重組緩沖液，而不是用NaHCO3霧化，改善了真皮FBs在生物打印真皮中的分布，它以前被用于膠原蛋白交聯(lián)。29然而，在這些打印條件下，將膠原前體與pH重組緩沖液混合會(huì)引發(fā)快速交聯(lián)，增加粘度和凝膠化，并可能堵塞打印組件。我們通過將皮膚生物墨水保持在4°C來解決這個(gè)問題，這是用Cellink BIOX生物打印機(jī)與一個(gè)可互換的冷卻打印頭，這是對(duì)于制造具有一致和高通量生物打印皮膚移植物非常重要。

我們發(fā)現(xiàn)，一段體外成熟的時(shí)間對(duì)于產(chǎn)生與在人類皮膚中觀察到的組織組織程度相當(dāng)?shù)钠つw水平至關(guān)重要。皮膚基底膜對(duì)表皮的完整性和功能很重要，包括滲透性屏障，形成真皮和表皮之間的粘附界面，并控制細(xì)胞的組織和分化。44–46暴露于ALI和成熟所需的培養(yǎng)條件通常被用來誘導(dǎo)皮膚等價(jià)物的表皮分化，47,48這些方法也在這里被使用過。例如，在ALI下培養(yǎng)26天的生物打印皮膚構(gòu)建物顯示了表皮分層標(biāo)記物(CK14、CK10和聚絲蛋白)，以及基底膜膠原IV的陽(yáng)性表達(dá)，表明了成熟的人類皮膚發(fā)育。然而，當(dāng)我們?cè)噲D在體外成熟的生物打印血管化移植物時(shí)，ALI培養(yǎng)導(dǎo)致血管退化和自組裝內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)的崩潰。

我們認(rèn)為，ALI引起的顯著失水對(duì)微血管的自組裝有不利影響結(jié)構(gòu)為了克服這一問題，我們采用了一種采用兩步法治療擬植入的皮膚結(jié)構(gòu)的方法。這種兩步方法在真皮產(chǎn)生開放腔的血管以及表皮基底KCs的分化。雖然這種方法可能會(huì)限制血管化生物打印構(gòu)建物在體外疾病建模中的使用，但我們認(rèn)為它是一種生產(chǎn)用于植入和體內(nèi)成熟的構(gòu)建物的優(yōu)越方法。

當(dāng)生物打印的移植物被植入免疫缺陷小鼠身上時(shí)，生物打印的帶血管化的皮膚移植物被灌注。移植后2周和4周出現(xiàn)人ECs內(nèi)襯的微血管。此外， 我們觀察到宿主微血管快速侵入移植物，特別是在含有ec外的pc的移植物中，這可能解釋了非血管化和血管化的生物打印移植物移植物的高存活率。與這些觀察結(jié)果一致的是，一些研究已經(jīng)描述了pc通過分泌生長(zhǎng)因子，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，49,50和基質(zhì)金屬蛋白酶，允許EC遷移。51我們的數(shù)據(jù)表明，在工程移植物中加入PCs可能會(huì)提高移植物的存活率。

FIG.    6.移植后4周的3D生物打印皮膚等效物的特征。(A)對(duì)放置在傷口邊緣的人總苞蛋白進(jìn)行免疫組化染色，顯示3D生物打印的血管化皮膚的表皮來自人類。比例尺：50mm。(B)生物打印移植物的代表性H&E圖像顯示了收縮的程度。沒有ec和pc的生物打印移植物明顯更小，小鼠皮膚占據(jù)的面積更大。生  物打印移植物和小鼠皮膚之間的邊界通過薄表皮、毛囊和深層真皮和脂肪組織來確定。比例尺： 1mm。含有人ec的(C)替代品在植入后4周含有血管結(jié)構(gòu)。通過GSL-B染色檢測(cè)小鼠微血管的存在和小鼠  巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)情況4和分別為F4/80抗體。為了證明人ec內(nèi)襯的血管被灌注，在外植體前30min注射熒  光UEA-1。箭頭指向人工灌注的人工血管。帶血管化的生物打印移植物顯示了網(wǎng)狀脊?fàn)罱Y(jié)構(gòu)的形成，特  別是在含有pc的生物打印移植物中。比例尺：100mm。彩色圖像可以在網(wǎng)上找到。

有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)在皮膚生物墨水中包含PCs也改善了移植4周后KC的成熟和表皮網(wǎng)的形成。這 References一觀察結(jié)果與之前的報(bào)道一致，即真皮PCs可以增強(qiáng)FBs對(duì)上皮細(xì)胞再生的旁分泌作用。52更具體地說，含有PCs的器官型培養(yǎng)顯示表皮增厚，基底層內(nèi)細(xì)胞高度極化組織和更有序的基上分層。在器官型培養(yǎng)中， 加入真皮PCs 增強(qiáng)了層粘連蛋白- 511/521 在真皮- 表皮交界處的沉積和BMP-2 的表達(dá)， 從而賦予了細(xì)胞極性和基底細(xì)胞分裂的數(shù)量。53我們需要進(jìn)一步研究PCs調(diào)控表皮成熟和宿主血管生成的外部線索。

皮膚組織替代的一個(gè)潛在瓶頸是產(chǎn)生皮膚等量物所需的大量細(xì)胞，因?yàn)樗鼈冎荒苤苯訌娜梭w活檢中少量獲得。此外，從受體自身的皮膚中獲得這種細(xì)胞可能是不切實(shí)際的，特別是在受體床受損的患者（例如，糖尿病、熱燒傷或腿部靜脈潰瘍）或血管生成受損的宿主中。54–56在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)HECFC來源的內(nèi)皮細(xì)胞可用于促進(jìn)生物打印皮膚移植物的血管化和灌注。這些可以很容易地從臍帶血或成人外周血中分離出來，57,58避免皮膚收獲。HECFC衍生的ECs可以擴(kuò)展到至少100倍，59允許產(chǎn)生更大尺寸的移植物。此外，這些ECs可以被克隆，允許基因修飾后的選擇。這一特性可能很重要，因?yàn)槌�了促進(jìn)移植物灌注， 人ECs還可以通過直接將非自身I類和II類HLA蛋白呈現(xiàn)給循環(huán)異反應(yīng)效應(yīng)記憶T細(xì)胞來啟動(dòng)免疫介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。這一人群一致存在于成人外周血中，并與臨床同種異體移植物的早期排斥反應(yīng)和通過過繼移植引入的免疫缺陷小鼠的人類皮膚排斥反應(yīng)相關(guān)。60相比之下，Apligraf，一種獲得FDA批準(zhǔn)的無血管雙層皮膚等效物，由于它缺乏專業(yè)的抗原呈遞細(xì)胞和ec，可能不會(huì)引起急性排斥反應(yīng)。61–63雖然含有未經(jīng)修飾的人ec的移植物具有同種免疫原性， 但這一特性可以通過CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的HLA抗原表達(dá)的缺失從HECFC來源的ECs中消除。64–66我們預(yù)計(jì)，通過植入不引發(fā)異反應(yīng)的3D生物打印人皮膚移植將具有巨大的臨床效用，并為創(chuàng)造“現(xiàn)成的” 臨床產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

皮膚的多層和分層結(jié)構(gòu)使其成為一個(gè)可以使用三維生物打印技術(shù)制作的原型組織。在這項(xiàng)研究中，我們證明了3D生物打印可以用于在體外從形態(tài)和生物學(xué)上與人類皮膚相似的人類細(xì)胞中制造有血管化的人類皮膚。總之， 我們展示了利用HECFC衍生的PCs和胎盤PCs生成包含可灌注微血管系統(tǒng)的植入式皮膚移植物的潛力。

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