當(dāng)受到環(huán)境刺激時(shí)，許多細(xì)胞類型使用鈣信號(hào)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信息處理并通過(guò)激活特定基因表達(dá)程序來(lái)誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)纳�物反�?yīng)。例如，鈣瞬變負(fù)責(zé)免疫細(xì)胞的激活。在本應(yīng)用說(shuō)明中，我們將對(duì) γδ T 細(xì)胞中的鈣瞬變進(jìn)行成像，以表征它們?cè)诹姿峄�抗原呈遞后的活化。所有這些實(shí)驗(yàn)都是使用 Inscoper liveRATIO 實(shí)現(xiàn)的，這是一種為比率成像量身定制的解決方案。

T淋巴細(xì)胞中的鈣信號(hào)
從細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)由第二信使介導(dǎo)。這些細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵參與者可能是核苷酸、脂質(zhì)、自由基或離子。它們都與特定目標(biāo)結(jié)合以誘導(dǎo)具有特異性的下游信號(hào)。例如，離子具有在信號(hào)誘導(dǎo)后誘導(dǎo)快速響應(yīng)的特性。鈣是一種普遍存在的次級(jí)信使，可調(diào)節(jié)多種途徑，如細(xì)胞存活、增殖、激活、神經(jīng)發(fā)生、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、肌肉收縮或神經(jīng)元突觸傳遞（Paemeleire 等人，2000 年； 貝里奇等人，2000，2003; 克拉彭，2007；格林伯格和康納思，2012； 休莫等人，2018；Zumerle 等人，2019 年）。
 
鈣在 T 細(xì)胞的活化中起主要作用。這些淋巴細(xì)胞是一類在適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的白細(xì)胞，具有在其表面呈遞 T 細(xì)胞受體 (TCR) 以檢測(cè)抗原存在的特殊性。在基礎(chǔ)條件下，靜息淋巴細(xì)胞維持細(xì)胞內(nèi)低濃度的鈣（維格和基內(nèi)特，2009 年）。然而，TCR 對(duì)抗原的識(shí)別會(huì)誘導(dǎo)其活化，其特征是細(xì)胞內(nèi)鈣水平的快速增加。
 
激活的 T 細(xì)胞然后能夠根據(jù)其類型參與免疫反應(yīng)：細(xì)胞毒性 T (CD8+) 細(xì)胞破壞受感染的細(xì)胞/病原體，輔助 T (CD4+) 細(xì)胞激活其他免疫因子，調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞 (Treg) 阻止激活在自身免疫淋巴細(xì)胞中，自然殺傷 T 細(xì)胞 (NKT) 分泌細(xì)胞因子并裂解抗原靶點(diǎn)。
其他一些 T 細(xì)胞被認(rèn)為是“非常規(guī)的”，如 MAIT 或 γδ T 細(xì)胞。所有這些細(xì)胞類型的協(xié)調(diào)對(duì)于免疫反應(yīng)的成功是必要的。
 
淋巴細(xì)胞是免疫防御機(jī)制的核心組成部分。它們的激活是免疫反應(yīng)所需的關(guān)鍵步驟之一�？梢允褂帽嚷食上癖O(jiān)測(cè)鈣瞬變來(lái)探索這種復(fù)雜的生理現(xiàn)象（巴拉戈帕蘭等人， 2011). 這項(xiàng)技術(shù)可以為研究人員提供一種提高對(duì)免疫細(xì)胞激活的理解和探索病理生理障礙的方法

INSCOPER LIVERATIO，比例成像的現(xiàn)代多功能解決方案
Inscoper liveRATIO 是用于比率成像的完整顯微鏡解決方案。該產(chǎn)品由與生命科學(xué)中使用的高級(jí)視頻顯微鏡兼容的軟件和硬件包組成（圖 1）
  圖 2：配備 Inscoper liveRATIO 的鈣比率成像實(shí)驗(yàn)裝置

鈣瞬變的比例成像​
目標(biāo)：
在這里，我們想要表征磷酸抗原呈遞后 γδ T 細(xì)胞的激活。為此，我們將監(jiān)測(cè)淋巴細(xì)胞中的鈣瞬變。
 
材料：
該實(shí)驗(yàn)是與顯微鏡設(shè)備 MicroPICell（法國(guó)南特）合作實(shí)現(xiàn)的。使用配備 HC Plan Apo 20x 0.70 NA（506166；Leica）的 Leica DMI 6000B 顯微鏡（Leica，Wetzlar，Germany）（圖 2）。對(duì)于這個(gè)實(shí)驗(yàn)，相機(jī)是數(shù)字 CMOS Orca Flash 4.0（C11440；Hamamatsu Photonics，Hamamatsu，日本），光引擎來(lái)自 CoolLED（pE-800富拉；CoolLED，Andover，UK）。使用 Inscoper liveRATIO (INSCOPER, Cesson-Sévigné, France) 進(jìn)行顯微鏡控制、采集和實(shí)時(shí)圖像處理。
 
方法：
γδ T 細(xì)胞用 Fura-2 AM（F1201；Thermofisher，Waktham，MA，USA）標(biāo)記，這是一種對(duì)游離細(xì)胞內(nèi)鈣具有高親和力的熒光探針。其在低鈣濃度（最大激發(fā) = 362 nm，最大發(fā)射 = 512 nm）下的光譜特性與高鈣條件（最大激發(fā) = 335 nm，最大發(fā)射 = 505 nm）下的光譜特性不同。 340nm 和 380nm 的激發(fā)可以分別用鈣結(jié)合和游離熒光探針成像。在采集過(guò)程中，將磷酸化抗原手動(dòng)添加到淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中，并監(jiān)測(cè)熒光。使用 DMSO（用于 Fura-2 稀釋）作為陰性對(duì)照也進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果：
許多染料根據(jù)其特性（結(jié)合鈣或在質(zhì)膜上被動(dòng)擴(kuò)散的能力、激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)、強(qiáng)度、亮度和穩(wěn)定性）用于進(jìn)行鈣成像。此外，可以使用非比率（更方便和更快，但不適合量化）或比率方法（更復(fù)雜但完全適合定量測(cè)量）進(jìn)行成像。