感受態(tài)細胞也能diy ?
標簽：感受態(tài)細胞   細胞膜 科普  離心管 

感受態(tài)細胞是分子蛋白生物學實驗中常用的一種菌株。常見的感受態(tài)有：用于藍白斑篩選鑒別的DH5a；用于表達毒性或非毒性蛋白的BL21菌株；用于 DNA及質(zhì)�？寺〉腡OP10菌株等。但是你知道嗎？其實感受態(tài)細胞也能DIY ，小編就帶領大家了解一下吧，動手能力強的小伙伴也可以試試噢。

一、化學感受態(tài)細胞的制備原理
化學感受態(tài)細胞基本上是經(jīng)過化學處理的細菌，使細菌能夠在情況需要時，吸收外源質(zhì)粒 DNA。當大腸桿菌的細胞膜被激活使質(zhì)�？梢暂p松 進入細胞內(nèi)部，這種吸收外源DNA的狀態(tài)稱為能力，化學感受態(tài)細胞主要是通過熱休克 進行轉(zhuǎn)化。



上圖中我們看出：
圖A中的細胞膜完整，外源DNA無法滲透；
圖B中的細胞通過處理，細胞膜通透性，外源DNA可以滲透；
 
要制備具有化學感受態(tài)細胞，需要培養(yǎng)一批大腸桿菌并進行繼代培養(yǎng)。然后，在大腸桿菌生長的對數(shù)增長進行收集，成為制備感受態(tài)細胞的原材料。因此，在對數(shù)生長期收集細胞至關重要。
整個實驗過程中，由于是不添加抗生素的，所以我們需要注意無菌操作，謹防感染。細胞收獲后，含有 15 % v/v甘油 ，濃度為 100 mM的 CaCl 2緩沖液進行處理，使膜對質(zhì)粒 DNA 具有半滲透性。
完成之后，將細胞分裝出來，置于在 -80 °C下冷凍即可。冷凍時注意加入定量的甘油成分，防止凍傷細胞。

二、制備前的準備：
1.在 LB 肉湯中生長的大腸桿菌菌株的新鮮過夜培養(yǎng)物。
2.進口的無菌離心管。
3.用于讀取大腸桿菌光密度的光譜儀。
4.含有 15 % v/v 甘油的 CaCl 2，濃度為 100 mM 。。
5.可耐-80°C以下環(huán)境的離心管或凍存管。

三、感受態(tài)細胞DIY實驗步驟
1.接種目的大腸桿菌菌株在 10 mL 的無菌 LB培養(yǎng)基中。于 37°C 下培養(yǎng)過夜，以 200 rpm 的速度搖晃。
2.將 1 mL 的過夜培養(yǎng)物重新接種到 99 mL 的無菌 LB 中，并在 37°C 下以 200 rpm 的速度搖動，直到達到 600 nm （OD 600）的光密度為 0.3 – 0.5（對數(shù)中期）。
3.將 100 mL 培養(yǎng)物平均分配在無菌離心管之間，并在 4 °C 下以 ~ 7000 rpm 離心 10 分鐘收集細胞。丟棄上清液并使用瑞寧移液器去除殘留的任何液滴。
4.將 20 mL ， 100 mM的無菌 CaCl 2溶液  添加到細胞中，并輕輕地重新懸浮細胞。
5.在 4°C 下以  7000 rpm 左右的冷凍離心機離心 10 分鐘左右，收集洗滌過的細胞并丟棄上清液。
6.加入 5 mL ，100 mM 的無菌CaCl 2，并輔以 15% v/v 甘油，然后輕輕地搖勻，使其重新懸浮。
7.用耐凍的離心管進行分裝，每管的分裝量以50 μL aliquits為宜。
8.將制備好的化學感受態(tài)細胞儲存在-80°C環(huán)境中。效期約為1 年。



實驗中的注意事項：
在進行感受態(tài)制備的過程中需要注意以下幾點：
由于具有化學活性的細胞失去細胞膜屏障，比較脆弱，所以在對大腸桿菌進行處理時需要輕柔對待。
由于培養(yǎng)物中不含抗生素，所以無菌操作很重要，尤其在進行細胞的OD 600檢查時。
在為整個實驗室組制備感受態(tài)細胞時，需要進行分裝登記并做好標識，置于-80以下環(huán)境中保存。

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