自17世紀(jì)中葉胡克用自制的顯微鏡發(fā)現(xiàn)了植物細(xì)胞以來(lái)，植物科學(xué)研究就一直與光學(xué)顯微鏡的發(fā)展密切相關(guān)。熒光標(biāo)記和光學(xué)切片的發(fā)展也大大地加快了我們對(duì)組織微觀形態(tài)、細(xì)胞發(fā)育、蛋白質(zhì)定位和植物-微生物相互作用的研究進(jìn)程，近年亞細(xì)胞級(jí)分辨率的3D成像技術(shù)也有助于研究植物的組織結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜的生理特性。然而，植物細(xì)胞本身的光學(xué)不透明特性使觀察植物體及其內(nèi)部組織器官受到極大限制，使成像深度被限制在了50μm左右。相比動(dòng)物，植物還含有一些光敏色素和芳香族化合物，這些成分也容易被激光激發(fā)，從而在成像時(shí)產(chǎn)生噪音。組織透明技術(shù)結(jié)合光學(xué)成像和圖像處理技術(shù)，能夠?qū)⒄麄�(gè)器官或全身快速透明并進(jìn)行結(jié)構(gòu)和細(xì)胞分析，為植物3D成像的發(fā)展提供了一個(gè)非常有前景的解決方案，能幫助研究人員在更接近自然的狀態(tài)下觀察植物的內(nèi)部構(gòu)造，有助于農(nóng)作物品種改良、內(nèi)部病蟲(chóng)害檢測(cè)等，對(duì)推進(jìn)植物學(xué)科領(lǐng)域的研究進(jìn)展具有重要意義。（圖1）

圖1. 植物組織透明、三維(3D)成像和數(shù)據(jù)分析流程

時(shí)至今日，科學(xué)界已經(jīng)涌現(xiàn)出許多先進(jìn)的透明化技術(shù)，它們各具特色，適合不同領(lǐng)域的研究。植物體由于有細(xì)胞壁和葉綠體等特殊組分, 導(dǎo)致光學(xué)透明技術(shù)在植物中的應(yīng)用面臨很大挑戰(zhàn)。植物組織不透明的原因主要有兩點(diǎn)：一點(diǎn)是色素對(duì)光的吸收，另一點(diǎn)是具有大范圍光折射率的細(xì)胞組分造成的光散射。為了達(dá)到生物樣本光學(xué)透明的目的, 可以采用化學(xué)或物理方法去除樣本中的色素和脂類(lèi)物質(zhì)從而減少樣本對(duì)光的吸收和散射,并將樣本浸入指定的匹配液中, 以獲得均勻的內(nèi)部折射率匹配。（圖2）

圖2.植物組織透明化原理

近二十年來(lái)，已有大量組織透明技術(shù)被開(kāi)發(fā)應(yīng)用在了植物組織成像領(lǐng)域。目前常用的植物組織透明方法可以分成基于有機(jī)溶劑的透明化方法和基于水性溶劑方法。

1．基于有機(jī)溶劑的光學(xué)透明技術(shù)

有機(jī)溶劑通常具有高脂溶解能力和高折射率(RI=1.5)的特點(diǎn), 可使處理樣品快速透明化。常見(jiàn)的有機(jī)溶劑透明化方法有BABB,3DISCO,uDISCO, vDISCO, PEGASOS等方法。這些方法都需要對(duì)樣品先進(jìn)行脫水，然后再用高折射率的試劑對(duì)樣品進(jìn)行折射匹配，從而實(shí)現(xiàn)樣品的組織透明�；�于有機(jī)溶劑的透明技術(shù)相對(duì)穩(wěn)定, 可用于多種不同類(lèi)型的組織。然而, 使用的有機(jī)溶劑大多具有毒性, 脫水過(guò)程中組織收縮嚴(yán)重, 以及導(dǎo)致熒光蛋白淬滅, 限制了有機(jī)溶劑透明方法的使用, 降低了其利用率。

Visikol® for Plant Biology™（锘海代理）是2013年Villani等人發(fā)明的專(zhuān)為植物樣本設(shè)計(jì)，可替代水合氯醛，快速、易用，樣本無(wú)需固定前處理，與免疫組化兼容的透明劑。他們將生姜、冬青、羅勒、牛至及擬南芥組織樣本分別使用Visikol試劑（折射率為1.4450）和水合氯醛進(jìn)行透明化處理及顯微觀察，結(jié)果表明Visikol試劑對(duì)所有被測(cè)組織樣本完全可以達(dá)到與水合氯醛一樣清晰度的成像效果。（圖3）

圖3. Visikol試劑透明化不同植物組織后顯微成像結(jié)果：羅勒葉片上有氣孔和頭狀、盾狀的腺體的表皮(圖1A)和葉肉細(xì)胞和葉綠體(圖1B)。牛至葉脈上的表皮毛(圖1C)、頭狀油腺細(xì)胞(圖1D)和盾狀油腺細(xì)胞(圖1E)和葉肉細(xì)胞(圖1F)。擬南芥根尖分生組織細(xì)胞(圖1G)和分化木質(zhì)部(圖1H)

Visikol 組織透明化試劑盒

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2．水溶劑性的組織透明化方法

基于有機(jī)溶劑的透明技術(shù)無(wú)法保持熒光蛋白的的熒光以及脫水引起的組織結(jié)構(gòu)的收縮，使基于有機(jī)溶劑的透明技術(shù)受到了限制。水溶劑性的組織透明化方法則具有熒光基團(tuán)保護(hù)性好，生物相容性好及操作安全的優(yōu)點(diǎn)。水溶劑性的組織透明化方法包括被動(dòng)浸泡型、蛋白水化型和水凝膠包埋型三種方法。

硫二甘醇 (TDE) 是一種水溶性低黏度液體, 可以通過(guò)水溶液稀釋調(diào)節(jié)折射率的范圍。透明植物器官成像方法TOMEI (transparent plant organ method for imaging)就是TDE作為透明化試劑的。動(dòng)物組織樣品在97% TDE溶液中浸泡1–2天后體積變得非常小。而在植物組織中, 用97% TDE處理不會(huì)導(dǎo)致植物器官的收縮或膨脹, 植物器官可能因細(xì)胞壁的剛性而顯示出對(duì)高濃度TDE的耐受性。TOMEI法主要包括固定和TDE處理2個(gè)步驟。TOMEI-I使用乙酸和乙醇（1：3，1-2h）的混合液固定樣本，TOMEI-II使用4%PFA（1h）固定樣本。TOMEI-II方法對(duì)樣品的形態(tài)和熒光信號(hào)保存相比TOMEI-I要好。除去固定因素，高濃度的TDE（95以上）也會(huì)使內(nèi)源熒光淬滅，而50–70% TDE可以很好的實(shí)現(xiàn)植物透明化而且對(duì)植物的樣本形態(tài)和信號(hào)保存較好。但是TOMEI依然存在無(wú)法完全去除樣品色素和熒光信號(hào)降低的缺點(diǎn)。2022年發(fā)表的iTOMEI技術(shù)可以克服TOMEI技術(shù)的缺點(diǎn)。iTOMEI技術(shù)使用1%PFA固定樣本，使用磷酸緩沖液（PH8.0）配制20%的硫代甜菜堿去除植物色素，使用70.4%的碘海醇代替TDE用作折射率匹配試劑（圖4）。

(A)

(B)

圖4.不同植物組織透明化方法比較：（A）擬南芥幼苗分別用PBS, TOMEI-II, iTOMEI透明化處理；（B）對(duì)用PBS, TOMEI-II, iTOMEI透明化處理后的擬南芥葉片的H2B-GFP表達(dá)情況進(jìn)行成像。

基于對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行水化的透明化方法包括樣本脫脂和蛋白水化兩個(gè)步驟。為了保護(hù)樣品的熒光信號(hào)，水性透明化方法使用表面活性劑進(jìn)行脫脂，表面活性劑的脫脂時(shí)間比有機(jī)溶劑脫脂時(shí)間長(zhǎng)。Warner團(tuán)隊(duì)使用Triton X、甘油與尿素結(jié)合使實(shí)現(xiàn)了玉米、苜蓿、煙草（豆屬，豌豆屬)和豆科植物的根瘤的組織透明化。Kurihara團(tuán)隊(duì)對(duì)多元醇、表面活性劑和尿素組合的化學(xué)試劑篩選后建立起木糖醇、脫氧膽酸鈉和尿素相組合的具有高透明效率、多種熒光蛋白信號(hào)保護(hù)能力并適用多物種多種組織的ClearSee透明化方法。ClearSee在保持熒光蛋白活性的同時(shí), 也降低了葉綠素自發(fā)熒光, 打破了植物組織由于葉綠素存在而造成的成像障礙。因此, 研究人員可使用ClearSee進(jìn)行多色成像, 并獲得植物樣本中精確的三維結(jié)構(gòu)和特定的基因表達(dá)模式。

但是在用ClearSee透明植物樣品的時(shí)候，會(huì)出現(xiàn)部分樣品褐化的現(xiàn)象，這是由于ClearSee處理會(huì)導(dǎo)致一些富含原花青素衍生物的組織被氧化從而使樣品褐化。Daisuke團(tuán)隊(duì)通過(guò)在ClearSee中添加還原劑亞硫酸鈉或者半胱胺鹽酸鹽可以有效的防止樣品褐化，從而建立了ClearSeeAlpha透明化方法，鑒于半胱胺鹽酸鹽的價(jià)格是亞硫酸鈉的100倍，故在ClearSeeAlpha中使用亞硫酸鈉（圖5）。Nagaki團(tuán)隊(duì)在ClearSee基礎(chǔ)上建立了ePro-ClearSee透明化方法，該法在進(jìn)行ClearSee透明化以前樣品先進(jìn)行纖維素酶對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行酶解，然后再用異丙醇處理增加樣品的通透性，從而使樣品更加適合進(jìn)行免疫組化反應(yīng)。

圖5.ClearSeeAlpha可以防止在組織透明化過(guò)程中褐色色素的形成：CS: ClearSee;CS4: ClearSee+ 2-aminoethanethiol hydrochloride(半胱胺鹽酸鹽); CS5: ClearSee+ 2- Sodium sulfite (亞硫酸鈉)

PEA-CLARITY是在CLARITY技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種水凝膠包埋型植物透明化方法，該方法通過(guò)使用細(xì)胞壁降解酶增加細(xì)胞壁的通透性, 以及用淀粉水解酶減少淀粉顆粒的光學(xué)干擾, 克服了植物因存在細(xì)胞壁和淀粉粒而造成的滲透和成像限制，可顯著提高葉片組織的透明度。酶處理在不需要對(duì)材料進(jìn)行任何切片的情況下可使抗體能夠滲透到整個(gè)組織中，在保留細(xì)胞結(jié)構(gòu)的同時(shí)使蛋白質(zhì)在完整組織中進(jìn)行3D定位。通過(guò)對(duì)熒光蛋白和抗體標(biāo)記進(jìn)行光學(xué)成像后, 無(wú)需對(duì)材料進(jìn)行任何切片即可獲取蛋白質(zhì)或基因在完整組織中的三維定位。但是PEA-CLARITY透明技術(shù)也存在局限性, 如糖含量較高的組織在長(zhǎng)時(shí)間透明過(guò)程中可能出現(xiàn)褐變現(xiàn)象, 酶處理后的組織更加脆弱, GFP等熒光蛋白的信號(hào)會(huì)減弱等。此外, 該方法處理周期較長(zhǎng), 通常需要4–6周才能完成樣本透明。

3．其它組織透明化方法

乳酸和水合氯醛是常被用于植物透明化的兩種試劑。它們能被用作植物的透明化試劑，主要是因?yàn)樗鼈兊恼凵渎试?.43左右，折射率是和植物細(xì)胞壁的折射率比較接近的。水合氯醛被廣泛的應(yīng)用于植物的組織透明化，它可以對(duì)擬南芥的葉片，花朵，角果等各種組織進(jìn)行透明化，而且還可以與品紅，苯胺藍(lán)，GUS等染色試劑聯(lián)合使用。水合氯醛還可以與希夫試劑聯(lián)合使用對(duì)細(xì)胞PI染色（mPS-PI）觀察植物的細(xì)胞壁。然而水合氯醛具有麻醉性，且會(huì)淬滅植物的內(nèi)源熒光，從而使該試劑在植物透明化上受到了一定的限制。

Shih等人使用不同濃度的氫氧化鈉、乳酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)水解酶、水合氯醛、甲苯及各種脂質(zhì)溶劑對(duì)種子進(jìn)行處理, 研發(fā)出一種改進(jìn)的氫氧化鈉-水合氯醛法, 可用于富含脂肪的種胚進(jìn)行透明化, 該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于楓樹(shù)、油菜、西瓜及向日葵等油脂貯藏量高的種胚透明。

盡管已有多種透明方法成功應(yīng)用于植物組織和器官的成像及其功能研究, 但現(xiàn)有透明方法應(yīng)用于大體積樣品的整體透明、標(biāo)記與三維成像等方面仍存在巨大挑戰(zhàn)。(1) 較為劇烈的透明化方法可去除細(xì)胞內(nèi)大部分光不透明成分, 獲得高度透明樣本, 后期結(jié)合細(xì)胞壁特異性染料或抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記或免疫標(biāo)記, 可實(shí)現(xiàn)大體積樣本內(nèi)細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)分布的熒光示蹤。但劇烈的透明化處理可能造成細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和成分被嚴(yán)重破壞, 難以對(duì)亞細(xì)胞組分和結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記和后續(xù)分析。 (2) 對(duì)于已有遺傳轉(zhuǎn)化體系且含有熒光標(biāo)記的植物樣本, 可以采用溫和透明方法進(jìn)行透明化處理后進(jìn)行三維可視化成像, 但樣本體積過(guò)大所需透明時(shí)間較長(zhǎng)且會(huì)降低組織內(nèi)部深處熒光信號(hào)的強(qiáng)度和對(duì)比度。(3) 對(duì)于尚未建立遺傳轉(zhuǎn)化體系的植物樣本, 可以利用抗體免疫標(biāo)記的方法進(jìn)行標(biāo)記與成像, 但仍需根據(jù)成像內(nèi)容和目的選擇合適的透明方法,防止透明化造成目標(biāo)物丟失。(4) 植物的果實(shí)和種子等致密大組織材料內(nèi)糖類(lèi)、淀粉和脂質(zhì)等含量較多, 透明方法仍需要進(jìn)一步優(yōu)化。總之與動(dòng)物組織研究相比，植物組織透明化方法的研究仍處于早期階段。鑒于不同植物器官的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和糖成分各不相同，所以植物組織透明化試劑還需要進(jìn)行進(jìn)一步系統(tǒng)的篩選。

透明化方法可以使組織透明，但要實(shí)現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)的可視化，還需要合適的成像工具。近年發(fā)展起來(lái)的光片顯微鏡就是適合組織透明化成像的工具。光片顯微鏡技術(shù)改變了傳統(tǒng)顯微鏡光源照射方式，在同樣信噪比的情況下光片顯微鏡可以將3D成像速度提高到共聚焦顯微鏡或雙光子顯微鏡的數(shù)十到數(shù)百倍，而光毒性減少數(shù)十至數(shù)百倍。因此光片顯微鏡技術(shù)以低光毒性、高速的三維成像優(yōu)勢(shì)而被Nature Methods評(píng)選為2014年的年度方法學(xué)。但是傳統(tǒng)光片顯微鏡存在對(duì)厘米級(jí)樣本進(jìn)行微米級(jí)或更高分辨率成像時(shí)成像效率不高的問(wèn)題。而平鋪光片技術(shù)作為一種新型的平面光片照明顯微技術(shù)，通過(guò)對(duì)空間光調(diào)制器加載不同的相位圖實(shí)現(xiàn)快速平鋪短而薄的光片，從而達(dá)到擴(kuò)大視場(chǎng)且不影響空間分辨率和光學(xué)層析能力，可以獲取在視野范圍內(nèi)各處成像分辨率均一的高分辨率圖像。锘海LS18光片顯微鏡采用了這種平鋪光片技術(shù)，克服了傳統(tǒng)光片顯微鏡中空間分辨率、光學(xué)層析能力和成像視野大小之間的矛盾，從而獲得均勻高分辨率的3D熒光圖像，使得3D透明化組織成像在生物醫(yī)學(xué)研究中更加可靠及可行。LS18已經(jīng)在腦科學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物研發(fā)、干細(xì)胞研究、組織胚胎學(xué)、組織病理診斷等各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

自主研發(fā)新型平鋪光片顯微鏡

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