染色體易位（8;21）是急性髓系白血病(AML)中最常見的遺傳病變之一，重排后 AML1的DNA結合結構域與轉錄抑制因子ETO融合，導致AML1-ETO（AE）融合轉錄因子的表達。AE抑制正常AML1功能的轉錄活性，阻斷其分化并促進了自我更新。常規(guī)化療是AE陽性AML主要治療方式，但常規(guī)化療不能治愈，且大量患者容易復發(fā)。迄今為止，尚未找到針對白血病融合蛋白AML1-ETO藥物靶點。

2022年2月德國格拉夫瓦爾德大學的Florian H. Heidel和和馬克斯·普朗克生物化學研究所Matthias Mann等團隊合作在Blood(IF 22.1)雜志上發(fā)表題為“PLCG1 is required for AML1-ETO leukemia stem cell self-renewal”的研究成果，利用DIA蛋白組學和轉錄組學發(fā)現由致癌融合蛋白AE驅動AML中磷脂酶C（PLC）信號通路發(fā)生變化，PLC家族中的PLC-gamma-1（PLCG1）鑒定為AE融合蛋白的特定靶標，確定PLCG1途徑是AML1-ETO 白血病的重要治療靶點。

圖1 PLC和Ca²⁺信號在AML1-ETO轉化的LSCs中富集

2. PLCG1是AML1-ETO的靶點
為了闡明AE-AML中PLCG1的高表達是否由AML1-ETO誘導，研究人員分析了AE-陽性SKNO1細胞、非AE細胞系(K562)和正常人CD34+細胞的AML1-染色質免疫共沉淀數據，發(fā)現只在AE-陽性SKNO1細胞的PLCG1啟動子區(qū)域檢測到與AML1特異性結合。AML1-ETO與不同的轉錄因子協(xié)同維持白血病細胞中PLGC1的高水平表達。研究人員進一步用多西環(huán)素(Dox)誘導的AML1-ETO人胚胎干細胞分化模型進行研究，發(fā)現PLCG1的表達與Dox同步且呈現Dox劑量依賴性。

圖2  PLCG1是AML1-ETO的靶點

3. AML1-ETO與非編碼元件的結合對PLCG1的表達至關重要
Chi-C實驗確定了幾個與PLCG1啟動子區(qū)域結合的基因組區(qū)域，為更一步驗證這些區(qū)域在AML1-ETO中的作用，研究人員采用CRISPR/Cas9技術，在AE-陽性 Kasumi-1和 SKNO-1細胞中，敲除PLCG1啟動子-128kb區(qū)域的與AE結合的500bp基因片段，發(fā)現PLCG1的mRNA表達量下降。進一步添加抑制劑阻止RNA聚合酶II招募于增強子區(qū)域，也發(fā)現PLCG1的表達量顯著降低。最后，研究人員采用CRISPR/ cas9敲除白血病活性所必須的轉錄因子，發(fā)現轉錄因子JUN、FOS和CREB的缺失將導致PLCG1 mRNA和蛋白表達量顯著降低，ChIP-seq實驗進一步發(fā)現AML1-ETO的缺失導致JUN與PLCG1啟動子的結合減少。以上結果說明，AML1-ETO與信號響應因子AP-1和CREB是AE細胞中PLCG1高表達所必須的。

圖3 AML1-ETO結合非編碼元件影響PLCG1的表達

4. AML1-ETO誘導的細胞功能依賴于PLCG1
為評估PLCG1的功能重要性，研究人員在skno1細胞、Kasumi-1細胞中分別采用CRISPR/ cas9技術對PLCG1基因敲除或用RNAi對PLCG1基因敲低，發(fā)現細胞增殖能力下降，且PLCG1的基因失活導致誘導分化的骨髓標記物如CD13和CD14的表達增加。研究人員進一步對PLCG1缺失Kasumi-1細胞進行轉錄組分析，發(fā)現與骨髓分化相關的基因上調，與增殖、干細胞干性和c-Myc靶標相關的基因下調，此外，被AML1-ETO抑制的基因在PLCG1敲低后顯著上調。這些結果表明，PLCG1缺失逆轉了人類AML細胞中AML1-ETO融合引發(fā)的基因表達變化。

圖4  AML1-ETO誘導的細胞功能依賴于PLCG1

5. AML1-ETO轉化細胞依賴于PLCG1
為了解PLCG1在AE白血病干細胞（AE-LSCs）中的作用，研究人員選用與臨床相關且侵襲表型更強的AML1-ETO9a (AE)和突變RAS (KRASG12D;K)(表示為AE/K)小鼠，建立了條件敲除小鼠模型。逆轉錄病毒表達導致Plcg1基因缺失，AE/K-LSCs (GFP+ LSK)細胞數目減少，并且AE誘導的體外無限增殖能力喪失。AE/K-LSCs中PLCG1的基因缺失也會損害次級受體宿主的白血病發(fā)展，然而在MLL-AF9 (MA9)轉化的白血病干細胞中PLCG1的基因缺失對干細胞數目和再次接種能力無影響。以上結果說明，AML1-ETO轉化的白血病干細胞生長依賴于PLCG1。

圖5  AML1-ETO轉化的造血干細胞依賴于PLCG1

6. PLCG1是維持AML1-ETO白血病干細胞所必需的
為了在體內證實以上推測，研究人員將亞致死劑量的AE/ k轉化的Plcg1F/F Mx-Cre+和Plcg1+/+ Mx-Cre+白血病干細胞注射到受體宿主中，并在移植后的連續(xù)時間點監(jiān)測，發(fā)現在注射pIpC誘導crec之前，兩組白血病干細胞具有相似定植能力。注射pIpC后，每個受體小鼠的AE/K Plcg1+/+細胞總數增加，直到發(fā)生明顯致命的白血病。Plcg1缺失導致受體宿主白血病發(fā)育喪失，白血病干細胞在外周血中數目下降，白血病干細胞出現分化誘導，細胞周期喪失，而對正常的造血干細胞無影響。連續(xù)注射5-氟尿嘧啶恢復造血功能，進一步證實只有AE驅動的AML白血病干細胞依賴于PLCG1維持自我更新能力。

圖6  PLCG1維持白血病干細胞的功能

7. Ca²⁺信號的藥理學干擾抑制AML1-ETO白血病干細胞的功能
到目前為止，還沒有針對PLCG1的特異性抑制劑。為了評估AE轉化細胞中依賴PLCG1的相關細胞功能，研究人員進行了深入的蛋白質組學分析，發(fā)現PLCG1缺失后412個蛋白顯著下調。GSEA分析發(fā)現PLCG1缺失后，下游Ca²⁺-信號通路變化極明顯。研究人員添加鈣調神經磷酸酶抑制劑環(huán)孢素A（CsA）后，發(fā)現AE陽性細胞增殖能力顯著降低，AE陽性白血病小鼠體內白血病癥狀減輕，導致二次受體宿主的疾病發(fā)病延遲，生存期延長，同時對AE陰性的MA9白血病小鼠無影響。此外CsA處理后，白血病干細胞數目減少，原代AE陽性AML細胞集落減少，而在正常造血干細胞中無影響。說明，靶向Ca²⁺-信號的藥物CsA，可以干擾AE驅動的白血病干細胞，進而影響AE-AML的發(fā)展與維持。

圖7  Ca²⁺-信號轉導影響AML1-ETO白血病干細胞的體內外功能
 

小編小結
本研究通過蛋白組學技術深入解析AML1-ETO型白血病的發(fā)病機理，發(fā)現PLCG1蛋白表達顯著變化。后續(xù)研究中發(fā)現在小鼠和人AML中PLCG1的基因失活抑制了AML1-ETO依賴的自我更新程序、白血病增殖和體內白血病維持。這些結果表明PLCG1通路可作為AML1-ETO陽性白血病干細胞的一個重要治療靶標。本研究為白血病臨床治療指出了新的方向。

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