Ca⁺⁺ Mg⁺⁺- ATP酶活性測定說明書
                                分光光度法50管/24樣
 
注   意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細(xì)胞中，可催化ATP水解生成ADP和無機(jī)磷。
 
測定原理：
根據(jù)Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶分解ATP生成ADP及無機(jī)磷，通過測定無機(jī)磷的量來確定ATP酶活性高低。
 
需自備的儀器及用品:
可見分光光度計(jì)、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
 
試劑的組成和配制：
提取液： 液體50mL ×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。
試劑三：液體 5ml×1 瓶，4℃保存。
試劑四：粉劑×3 支，-20℃保存。用時每支加1mL蒸餾水，現(xiàn)用現(xiàn)配；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑五：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。
試劑六：粉劑×1瓶，4℃保存。用時加入3mL蒸餾水， 4℃保存。
試劑七：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時加入25mL蒸餾水，溶解后4℃保存一周。
試劑八：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時加入25mL蒸餾水，溶解后4℃保存一周。
試劑九：液體25mL×1 瓶，室溫保存。
試劑十：10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。
0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將試劑十 20倍稀釋，即取 0.1mL試劑十加1.9mL蒸餾水充分混勻。
定磷劑的配制：按H₂O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
 
樣品酶液的制備：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
 
2、血清（漿）樣品：直接檢測。
 
操作步驟：
1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至660nm，蒸餾水調(diào)零。
2、酶促反應(yīng)（在EP管中加入下列試劑）

	對照管	測定管
試劑一（μL）	130	90
試劑二（μL）	40	40
試劑三（μL）	40	40
試劑四（μL）	40	40
試劑五（μL）		40
樣本  （μL）		200

混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴10min

試劑六（μL）	50	50
樣本 （μL）	200

混勻，8000g，25℃離心10min，取上清液
3定磷（1.5mLEP管中依次加入下列試劑）

	空白管	標(biāo)準(zhǔn)管	對照管	測定管
0.5μmol/ml標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液（μL）		100
上清液（μL）			100	100
蒸餾水（μL）	100
定磷試劑（μL）	1000	1000	1000	1000

混勻，室溫放置30 min，在 660nm處比色。
 
注意事項(xiàng)：
1、由于每一個樣都必須做對照，本試劑盒50管只能測 24份Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶。
2、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對測定所用試管要求嚴(yán)格無磷。避免磷污染是檢測成敗的關(guān)鍵。
3、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。
 
計(jì)算：
1、血清（漿）Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-  ATPase活力的計(jì)算:
定義：規(guī)定每小時每毫升血清（漿）中Ca⁺⁺ Mg⁺⁺- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。
Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶活力（μmol /h/ mL）=[ C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷V樣÷T=7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）
組織中Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-  ATPase的計(jì)算： 
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-  ATPase活力的計(jì)算：
（1）按蛋白濃度計(jì)算：
定義：每小時每毫克組織蛋白中Ca⁺⁺ Mg⁺⁺- ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。
Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶活力(μmol/h/mg)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷（V樣×Cpr）÷T =7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
 
定義：每小時每克組織中Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。
Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶活力(μmol/h/g)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷(W× V樣÷V樣總)÷T=7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
定義：規(guī)定每小時每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞中Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個酶活力單位。
Ca⁺⁺ Mg⁺⁺-ATP酶活力(μmol/h /10⁴)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.015×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）
C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/mL；V總：酶促反應(yīng)總體積，0.5mL；V樣：加入樣本體積，0.2mL ；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，1/6小時；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。