截至目前，超過5種CAR-T細胞治療產(chǎn)品獲得美國FDA認證，批準上市。國內(nèi)首款CAR-T產(chǎn)品也已獲批上市。但CAR-T產(chǎn)品也存在著生產(chǎn)周期長、有細胞因子風暴及神經(jīng)毒性副作用等挑戰(zhàn)。
 

CAR-NK細胞被認為可能應對這些挑戰(zhàn)，其發(fā)展引起了研究人員的極大興趣——主要是因為相比傳統(tǒng)的CAR-T細胞，CAR-NK細胞具有獨特的優(yōu)勢。與CAR-T細胞不同，CAR-NK細胞可以應用于異體細胞治療環(huán)境，這意味著它有潛力成為一種“現(xiàn)成的”治療方法，并降低移植物抗宿主病(GVHD)的風險，解決了周期長，必須應對個體化需求的問題。CAR-NK細胞不像CAR-T細胞那樣在體內(nèi)長時間存活，從而降低了靶向正常細胞和非腫瘤細胞的風險。此外，由于NK細胞分泌的細胞因子相與T細胞不同，NK細胞造成細胞因子釋放綜合征(CRS)和神經(jīng)毒性的風險較低。
 

更重要的是，CAR在NK細胞中的表達可以增加其固有的細胞殺傷能力，改善未修飾前NK細胞的治療結果。已知未修飾的NK細胞臨床前研究已經(jīng)產(chǎn)生了很好的結果及安全性，但仍未轉(zhuǎn)化為成功的臨床實驗，雖有多達50%的患者中產(chǎn)生了陽性反應，但其他實驗報告的臨床療效還是有限。提示我們CAR修飾的NK細胞治療可能是更好的治療方案。
 

慢病毒NK細胞轉(zhuǎn)染方案

限制CAR-NK細胞治療發(fā)展的挑戰(zhàn)之一是基因轉(zhuǎn)染方式。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已被廣泛研究，轉(zhuǎn)染后在NK細胞中的效率約為27%-52%。以及轉(zhuǎn)染后CAR-NK細胞活力低和突變的風險而受到限制。一種更安全的選擇是用慢病毒(LV)轉(zhuǎn)染，因為它提供了降低基因毒性和插入突變的風險。然而，其轉(zhuǎn)染效率往往比逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)錄效率要低得多。
 

CAR-NK細胞有幾種類型的慢病毒(LV)正在開發(fā)中，最近人們對優(yōu)化vesicular stomatitis virus-G (VSV-G)-pseudo typed LV(VSV-G LVs)的轉(zhuǎn)染很感興趣。
 

 

St. Jude兒童研究醫(yī)院的研究人員于2021年6月在Cytotherapy雜志發(fā)表文章，研究表明，VSV-GLVs轉(zhuǎn)染的NK細胞轉(zhuǎn)染效率低和細胞活力低是由于toll樣受體4(TLR4)通路的激活。

VSV-G激活TLR4信號通路

免疫系統(tǒng)使用模式識別受體，如toll樣受體，來識別細菌和病毒的病原體相關分子模式(PAMPs)。TLR4以其能夠識別革蘭氏陰性菌外膜上的脂多糖(LPS)而聞名，也能識別病毒。
 

NK細胞在細胞表面和細胞內(nèi)均表達TLR4，使得NK細胞對VSV-GLV激活TLR4通路特別敏感。VSV-G激活胞內(nèi)TLR4信號通路，從而誘導信號級聯(lián)，最終導致I型干擾素的產(chǎn)生。基于以往的研究，我們認為VSV-GLV的轉(zhuǎn)染效率較差，可能是由于TLR4通路的激活所致。因此，Chockley等人研究了使用藥物MRT67307抑制TLR4通路的下游信號分子TBK1和IKKε。

單細胞功能蛋白質(zhì)組技術評價基因編輯的NK細胞

研究表明，在轉(zhuǎn)染方案中使用MRT67307，顯著提高了NK細胞中HER2-CAR的轉(zhuǎn)染效率，高達18%-53%的細胞表達CAR（圖1），平均數(shù)為34%。

圖1：CAR表達百分比

此外，作者在針對HER2+A549細胞系的4小時細胞毒性實驗中評估了CAR的功能，HER2-CAR NK細胞表現(xiàn)出對腫瘤細胞的顯著殺傷。在MRT67307的存在下，轉(zhuǎn)染的HER2-CAR-NK細胞的腫瘤殺傷力顯著提高（圖2）。

圖2：共培養(yǎng)細胞毒性實驗

研究者使用IsoPlexis的單細胞分泌組解決方案評估HER2 CAR-NK細胞的細胞因子分泌譜。與未修飾的NK細胞相比，兩種細胞的多功能性（分泌兩種及兩種以上因子的能力）存在顯著差異，主要表現(xiàn)在未經(jīng)修飾的NK細胞平均分泌2-3個效應分子，其中不到13%的細胞分泌顆粒酶B，少于3.5%的細胞分泌其他細胞因子，多功能細胞占整個細胞的比例小于20%；而HER2 CAR-NK細胞中的部分亞群則能夠產(chǎn)生多達10種效應分子，細胞分泌一系列的效應細胞因子，包括：顆粒酶B、穿孔素、TNF-α、MIP1-β、MCP-1、RANTES和IL-8，其多功能細胞占比超過50%（圖3）。

圖3：NK細胞多功能性，細胞因子譜，多功能指數(shù)的差異。

本研究的數(shù)據(jù)表明，抑制TBK1和IKKε顯著改善了NK細胞的轉(zhuǎn)導，并產(chǎn)生了功能完整的細胞產(chǎn)物，與未修飾的NK細胞和沒有MRT67307轉(zhuǎn)導的NK細胞相比，CAR-NK細胞表現(xiàn)出更優(yōu)越的細胞毒性能力。

利用IsoPlexis的單細胞蛋白質(zhì)組學平臺發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)，作者能夠表征使用VSV-Glv轉(zhuǎn)基因NK細胞的可靠性。該研究的NK細胞轉(zhuǎn)導方法有可能適用于異源基因CAR-NK細胞治療的臨床生產(chǎn)，這在現(xiàn)成的細胞治療研究領域具有重大的意義。

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