一、無(wú)菌操作

細(xì)胞培養(yǎng)最看重的就是無(wú)菌操作，無(wú)菌操作是細(xì)胞培養(yǎng)是否成功的關(guān)鍵點(diǎn)。

1、使用前用75%的乙醇擦拭細(xì)胞間的桌面、超凈臺(tái)、孵箱和離心機(jī)等；紫外照射細(xì)胞間和超凈臺(tái)30分鐘以上才可以進(jìn)入使用。

2、進(jìn)入細(xì)胞間必須穿上隔離服或者細(xì)胞間專(zhuān)用的白大衣，戴上手套和口罩，換上拖鞋，嚴(yán)格意義上來(lái)說(shuō)，帽子也是要帶的。除了隔離服，其他穿著物品最好一次性使用。

3、凡是放入超凈臺(tái)中的不是一次性使用的物品事先都需要經(jīng)過(guò)高壓滅菌；不能進(jìn)行高壓處理的物品也需要經(jīng)過(guò)75%的乙醇消毒。包括酒精燈、吸管、移液器、試管架、培養(yǎng)皿、廢液缸等。

4、操作過(guò)程中盡量接近酒精燈；用鑷子拿取槍頭、離心管、吸管等物品時(shí)，避免碰到使用端；不要在開(kāi)口器皿的上端進(jìn)行操作。

5、細(xì)胞間的設(shè)計(jì)都是一層層的隔間，每一層隔間的拉門(mén)都必須關(guān)好；當(dāng)有人在超凈臺(tái)工作時(shí)，其他人員不允許進(jìn)入操作區(qū)域。

二、培養(yǎng)基

1、培養(yǎng)基的選擇依細(xì)胞種類(lèi)而定。如果是從別的實(shí)驗(yàn)室借來(lái)的細(xì)胞，最初階段一定要保持細(xì)胞原有的培養(yǎng)條件；特殊種類(lèi)的細(xì)胞，比如內(nèi)皮細(xì)胞，可以借鑒網(wǎng)上培養(yǎng)成功的條件，添加一些特定成分。

2、液體培養(yǎng)基的保存條件應(yīng)是冰箱4度冷藏。小六兒見(jiàn)過(guò)有的大實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞量多，一次性購(gòu)買(mǎi)的培養(yǎng)基瓶數(shù)也多，有些人可能覺(jué)得-20冰箱保存時(shí)間會(huì)更久一些。但是經(jīng)過(guò)冷凍后的培養(yǎng)基再溶化時(shí)，你會(huì)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的顏色發(fā)生變化，顏色變深，這就是培養(yǎng)基的PH值升高了。

3、培養(yǎng)基中都含有大量的谷氨酰胺，用來(lái)合成細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的核酸和蛋白質(zhì)。但是谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定，保存4周后的培養(yǎng)基需要重新加入谷氨酰胺。所以盡量不要大批量購(gòu)買(mǎi)培養(yǎng)，也不要一次配太多的培養(yǎng)基。

4、細(xì)胞適合的培養(yǎng)基PH值是7.2-7.4，偏高或偏低都不好，但相對(duì)于堿性條件而言，細(xì)胞更耐酸。原代細(xì)胞對(duì)PH值的變化很敏感，而永生性細(xì)胞相對(duì)來(lái)說(shuō)忍受力更強(qiáng)一些。

5、造成皿或瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基PH值變化的原因有很多：細(xì)胞增殖速度的快慢、孵箱內(nèi)二氧化碳的濃度不準(zhǔn)確、培養(yǎng)瓶的蓋子擰緊或者發(fā)生了污染。如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)慢，刨除細(xì)胞本身狀態(tài)的原因，可以在培養(yǎng)液中添加丙酮酸鈉（丙酮酸鈉是糖酵解的中間產(chǎn)物，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供ATP，提供合成大代謝所需要的碳源，使用濃度通常是0.1mM）。

6、細(xì)胞發(fā)生污染，培養(yǎng)基的PH值也會(huì)發(fā)生變化。如果新配置的培養(yǎng)基出現(xiàn)沉淀，很可能是廣口瓶沒(méi)有清洗干凈，瓶中殘留的磷酸鹽造成培養(yǎng)基成分的析出。

7、孵箱內(nèi)濕度對(duì)維持培養(yǎng)基的滲透壓也有很重要的作用。大部分細(xì)胞適應(yīng)的滲透壓在260-320mOsm/kg。濕度不夠時(shí)，培養(yǎng)基蒸發(fā)，液體的滲透壓就會(huì)升高。

8、培養(yǎng)基在使用前需提前從冰箱拿出，使其恢復(fù)至室溫或者37度水浴。

9、操作過(guò)程中，如果槍頭中已經(jīng)有培養(yǎng)基或其他液體成分，不要再經(jīng)過(guò)酒精燈被高溫加熱。高溫不僅會(huì)使有效成分失效，更有可能產(chǎn)生有毒物質(zhì)。

10、我們購(gòu)買(mǎi)的培養(yǎng)基瓶上都會(huì)標(biāo)注避光保存，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的某些成分遇光會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化氫，具有細(xì)胞毒性。我們?cè)诔瑑襞_(tái)中處理細(xì)胞時(shí)，因?yàn)闀r(shí)間較短，不會(huì)產(chǎn)生太大問(wèn)題。但是如果長(zhǎng)時(shí)間放置在室外或燈光下照射，或者有的冷藏冰柜的門(mén)是玻璃的，就會(huì)造成培養(yǎng)基質(zhì)量的下降。 

三、血清

1、血清分為：

a)新生牛血清（新生的小牛5天內(nèi)取血）；

b)小牛血清（16周內(nèi)的小牛取血）；

c)胎牛血清（剖腹取出胎兒制成的）。

2、我們買(mǎi)來(lái)的血清多處于冰凍狀態(tài)，滅活前放到4度冰箱，使其緩慢溶化。56度水浴45分鐘滅活，滅活后冷卻至室溫再放回冰箱冷凍層中。滅活是滅活補(bǔ)體系統(tǒng)中具有蛋白酶活性的成分，對(duì)于一些難養(yǎng)的細(xì)胞，滅活補(bǔ)體是很重要的。但是滅活的溫度也可能會(huì)破壞血清中的生長(zhǎng)因子，所以到底該不該滅活血清，還沒(méi)有一個(gè)很明確的標(biāo)準(zhǔn)，可能還是要視情況而定吧。

3、血清在溶化過(guò)程中，纖維蛋白原會(huì)轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，所以有時(shí)我們會(huì)看到絮狀物，但是這種情況是不影響血清的質(zhì)量的。

四、傳代

1、貼壁細(xì)胞傳代時(shí)，先用消化液潤(rùn)洗一遍；棄掉后，再加入適量消化液置于孵箱或鏡下觀(guān)察消化；當(dāng)細(xì)胞變圓，彼此之間產(chǎn)生空隙，加入等量或大量的培養(yǎng)基終止消化，培養(yǎng)基中的血清可以抑制胰蛋白酶的活性。

2、這里我沒(méi)有明確提到胰蛋白酶的濃度，并不是說(shuō)濃度越高越好。胰蛋白酶底物的特異性差，會(huì)破壞細(xì)胞膜成分。PH8.0，37度環(huán)境下，消化液的消化能力是最強(qiáng)的。培養(yǎng)基中的血清會(huì)降低胰酶的消化能力，所以每次消化前，也要用PBS反復(fù)沖洗干凈培養(yǎng)皿。日常用的比較多的消化液濃度：

a)0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA

b)0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA 

c)0.25%胰蛋白酶

3、傳代后如果細(xì)胞不貼壁，可能的原因是胰蛋白酶消化過(guò)度或者沒(méi)有清洗干凈EDTA。

4、懸浮細(xì)胞傳代時(shí)，正常收集細(xì)胞、離心濃縮、用培養(yǎng)基重懸就可以了。懸浮細(xì)胞每次換液都需要離心重懸，但是由于懸浮細(xì)胞一般會(huì)處于單細(xì)胞層生長(zhǎng)，有的時(shí)候生長(zhǎng)速度很快，重懸后如果不晃動(dòng)培養(yǎng)皿，就會(huì)看到細(xì)胞成團(tuán)；如果經(jīng)常顯示懸浮細(xì)胞大量抱團(tuán)生長(zhǎng)，也有可能是培養(yǎng)基中的血清問(wèn)題、或者鈣鎂離子濃度的變化造成了細(xì)胞間的粘附力改變。

五、細(xì)胞死亡及生長(zhǎng)異常

1、首先講一下細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢的原因：

a)更換了血清或者培養(yǎng)基，細(xì)胞需要一段時(shí)間適應(yīng)一下；

b)由于細(xì)胞的特殊種類(lèi)，培養(yǎng)基中缺少某些生長(zhǎng)因子；

c)培養(yǎng)基中有少量真菌或者細(xì)菌污染；

d)傳代的時(shí)候細(xì)胞密度過(guò)低；

e)細(xì)胞狀態(tài)老化；

f)支原體污染。

2、解決上述問(wèn)題的方法：

a)如果實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有某種細(xì)胞最適宜的培養(yǎng)基，可以先用原培養(yǎng)條件凍存一些，然后逐漸增加新的培養(yǎng)基比例，25%、50%、75%到100%，傳代3-5次后，讓細(xì)胞慢慢適應(yīng)。

b)判斷是不是培養(yǎng)基發(fā)生污染，可以先不加抗生素，觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)。

c)增加細(xì)胞的接種密度。

d)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞老化的時(shí)候，及時(shí)更換新的細(xì)胞。

e)如果懷疑是支原體污染，一定要隔離疑似污染的培養(yǎng)皿，及時(shí)清潔消毒孵箱。

3、造成細(xì)胞死亡的原因：

a)細(xì)胞消化過(guò)度；

b)沒(méi)有及時(shí)換液，營(yíng)養(yǎng)成分消耗殆盡；

c)如果前一天細(xì)胞的狀態(tài)很好，換液之后就全死了，應(yīng)該考慮是否是培養(yǎng)基或者血清的問(wèn)題。

4、如何判定細(xì)胞是否發(fā)生支原體污染：可以選用直接培養(yǎng)法、熒光染色或PCR方法檢測(cè)，比較常用的是PCR。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生支原體污染時(shí)，原則上是能夠去除支原體的，但是整個(gè)過(guò)程耗時(shí)耗力，還要考驗(yàn)個(gè)人操作能力。所以如果不是處于細(xì)胞存量很少的情況下，建議發(fā)現(xiàn)污染時(shí)立刻棄掉，重新培養(yǎng)。

5、如果孵箱中只是某種細(xì)胞持續(xù)性大量死亡，而其他細(xì)胞狀態(tài)都沒(méi)問(wèn)題的話(huà)，基本上可以確定就是孵箱存在特異性感染這類(lèi)細(xì)胞的真菌或細(xì)菌，遇到這種情況，小六兒也不知道該怎么做，只能是先停一段時(shí)間看看。。。。。。

6、其他注意事項(xiàng)：每個(gè)星期都要更換孵箱底盤(pán)中的水（紫外照射后超純水）；每?jī)芍芟�毒一次孵箱�?5%酒精擦拭一遍后，再用0.1%新潔爾滅擦拭一遍（都用超純水配制）；可以在孵箱底部放一個(gè)燒杯，里面放入飽和硫酸銅，可以抑制霉菌生長(zhǎng)。不過(guò)也有人說(shuō)硫酸銅會(huì)改變孵箱的PH值，如果不是孵箱污染的情況很?chē)?yán)重，建議不要使用。