一、細胞簡介：

細胞名稱：人成巨核細胞白血病細胞MEG-01/(STR鑒定正確）

智立編碼：20211259101220138

MEG-01人成巨核細胞白血病細胞源自一位CML患者成巨核細胞轉(zhuǎn)換期的骨髓細胞。細胞質(zhì)因子VIII和表面球蛋白IIb/IIIa，高碘酸-Schiff(PAS)反應(yīng)，α醋酸萘酯酶和酸性磷酸酶陽性。髓過氧化物酶，α丁酸萘酯酶，氯化醋酸AS-D萘苯酚酯酶和堿性磷酸酶陰性。用單克隆抗體BA-1(抗B細胞，粒性白細胞)，HPL-3(抗球蛋白IIb/IIIa)和20.3(抗單核細胞，血小板)染色成陽性。其他淋巴和骨髓類抗體成陰性。

二、培養(yǎng)步驟

1）復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打細胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。

三、應(yīng)用

用于MicroRNA-223調(diào)控急性缺血性卒中患者氯吡格雷治療后血小板反應(yīng)性的機制研究：

通過建立氯吡格雷肝微粒體孵育液處理MEG-01細胞的實驗?zāi)Ｐ?使得氯吡格雷可以直接在體外完成代謝活化并進行細胞實驗,并利用該細胞模型相關(guān)實驗與相關(guān)臨床研究,對氯吡格雷治療低反應(yīng)的機制的進行了更深一步的探討。

MicroRNA-223與急性缺血性卒中患者血小板ADP受體P2Y12和氯吡格雷反應(yīng)性的相關(guān)性分析目的：探討急性缺血性卒中患者氯吡格雷治療前后血小板膜蛋白P2Y12表達水平與血小板反應(yīng)性的關(guān)系,以及miR-223在其中的調(diào)控作用。方法：采用流式細胞術(shù)檢測急性缺血性卒中患者治療前后ADP誘導血小板聚集率,通過血小板相對抑制率及八分位數(shù)法篩選出低反應(yīng)組和高反應(yīng)組,檢測極端病例治療前后血小板中P2Y12蛋白表達水平,并比較分析其在兩組極端病例中的差異;構(gòu)建病毒載體感染人成巨核細胞白血病細胞MEG-01,下調(diào)miR-223水平,觀察靶基因P2Y12蛋白及mRNA水平表達變化。

結(jié)果：在急性缺血性卒中患者中,無論在治療前水平還是治療后水平,血小板P2Y12的蛋白表達水平與血小板聚集率均呈顯著正相關(guān)（p<0.05）。高反應(yīng)組治療后較治療前P2Y12蛋白表達水平有所降低,但無統(tǒng)計學意義（p=0.073）。

低反應(yīng)組治療前后血小板P2Y12蛋白表達的改變程度較高反應(yīng)組顯著減低（1.14604vs0.77097,p=0.031）。通過構(gòu)建病毒載體感染下調(diào)MEG-01細胞中miR-223水平,可以顯著升高P2Y12mRNA水平和蛋白水平的表達。

結(jié)論：氯吡格雷低反應(yīng)組治療前后血小板P2Y12蛋白表達的相對降低程度較高反應(yīng)組顯著減低;在人血小板前體細胞中,miR-223可以調(diào)控ADP受體蛋白P2Y12的表達。

氯吡格雷肝微粒體孵育液處理人成巨核細胞白血病細胞模型的建立及其對miR-223表達的影響目的:建立氯吡格雷肝微粒孵育液處理人成巨核細胞白血病細胞MEG-01的細胞處理模型,并探討氯吡格雷孵育液處理對miR-223表達所產(chǎn)生的影響,為從細胞水平探索氯吡格雷治療對人體血小板所產(chǎn)生影響提供新的方法學依據(jù)。

方法：利用毒理學研究方法,以肝微粒體和氯吡格雷在適宜體系條件下共同孵育,獲得含有氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物的孵育液。觀察不同濃度梯度和不同時間節(jié)點氯吡格雷肝微粒體孵育液處理MEG-01細胞后P2Y12蛋白水平的表達變化,確定細胞模型最佳處理濃度和時間,觀察細胞中miR-223表達變化。

結(jié)果：在低（100ul/2ml）、高（200ul/2ml）兩種濃度下氯吡格雷孵育液處理MEG-01細胞后,P2Y12蛋白表達均無顯著變化（p>0.05）。在以200ul/2ml的濃度連續(xù)處理5天的條件下,氯吡格雷孵育液組細胞膜P2Y12蛋白表達較對照肝微粒體孵育液組顯著降低42.6%（p<0.01）。在以200ul/2ml的濃度分別連續(xù)處理3天、5天后,氯吡格雷孵育液處理的MEG-01細胞中miR-223表達分別下降了47.3%和32%（p值均<0.05）。