在組織中研究多種蛋白質(zhì)的空間位置關(guān)系，尤其是在三維組織中，在相當(dāng)多的生物醫(yī)學(xué)研究中都有非常重要的意義。但是熒光多重標(biāo)記技術(shù)存在諸多限制，并且目前能實(shí)現(xiàn)多重標(biāo)記的方法都只支持使用薄的組織切片（<100μm）。這篇文章的研究者利用了受激拉曼光譜成像檢測(cè)光譜比較窄，不易產(chǎn)生信號(hào)串?dāng)_的優(yōu)點(diǎn)，在透明化組織成像中引入了特殊的地中海拉曼探針，對(duì)厚達(dá)1mm的組織進(jìn)行了一次性多靶標(biāo)成像。

受激拉曼顯微技術(shù)檢測(cè)光譜比較窄、信號(hào)不容易產(chǎn)生串?dāng)_，但是其信號(hào)比傳統(tǒng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度弱，常規(guī)方法很難檢測(cè)到。研究者結(jié)合電子預(yù)共振光譜（electronic pre resonance spectroscopy）和受激拉曼顯微技術(shù)（Stimulated Ramen Scattering microscopy）,可以使染料的拉曼吸收截面增加10¹³倍，彌補(bǔ)了拉曼信號(hào)弱、很難檢測(cè)的缺點(diǎn)。研究者設(shè)計(jì)了地中海拉曼檢測(cè)探針（MARS）結(jié)合優(yōu)化的透明化技術(shù)（rDISCO: Raman 3D imaging of solvent -cleared organs），達(dá)到了在1mm厚的組織上11種靶標(biāo)的同時(shí)成像。 

首先，研究者設(shè)計(jì)了地中海拉曼探針MARS。MARS探針使用π形連接的三鍵產(chǎn)生電子放大，可以使染料的拉曼吸收截面增加10¹³倍，彌補(bǔ)了拉曼信號(hào)弱、很難檢測(cè)的缺點(diǎn)。在生物細(xì)胞中MARS受激拉曼檢測(cè)光譜為1800-2300cm^-1。因?yàn)樗�有的透明化試劑�?000-2400cm^-1光譜范圍內(nèi)都不產(chǎn)生信號(hào)，所以沒有背景。NHS Ester是常用可以和探針結(jié)合的活性基團(tuán)，已知有4種已經(jīng)連接了NHS Ester 的MARS探針，研究者新研發(fā)了另外四種與NHS Ester 連接的MARS探針，它們和已知的四種地中海拉曼探針在核心原子、環(huán)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量、與氮原子的結(jié)合方式上存在差異。圖1顯示了它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)和光譜特性。


圖 2 c tubulin成像 d 免疫熒光和SRS圖像的比較 g 薄腦片的12種靶標(biāo)同時(shí)成像。
Fluorescence: DNA (DAPI), vesicular glutamate transporter 1 (VGluT1-Alexa Fluor 488, glutamatergic neurons, direct immunolabeling), tyrosine hydroxylase (TH-Alexa Fluor 594, dopaminergic neurons, direct immunolabeling) and F-actin (Phalloidin-Alexa Fluor 647); epr-SRS: neuronal nuclei (NeuN; neurons, MARS2228), α-tubulin-MARS2176 (direct immunolabeling), calbindin (CB;
Purkinje neurons, MARS2145), β-III-tubulin (TUBB3; neurons, MARS2200), wheat germ agglutinin (WGA; MARS2242), GABA (γ-aminobutyric acid) B receptor 2 (GABBR2; GABAergic neurons, MARS2212), myelin basic protein (MBP; oligodendrocytes, MARS2188) and GFAP (astrocytes and neural stem cells, MARS2159).

使用這些MARS探針和抗體結(jié)合后，可以對(duì)組織內(nèi)不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行成像。與傳統(tǒng)的免疫熒光圖像類似（圖2c）。這種方法可用于石蠟和冰凍組織切片的成像。將MARS探針連接lectin就可以看到細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，因?yàn)樘结樀臋z測(cè)光譜很窄，只有12 cm^-1，這樣就可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)不同的拉曼探針同時(shí)成像。因此，研究者在小鼠腦切片上標(biāo)記了12種marker（8種MARS和4種熒光，圖2g）,可以識(shí)別出腦片中的不同細(xì)胞，包括神經(jīng)元顆粒細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、單樹突細(xì)胞等。


圖3 各種透明化方法的SRS成像效果，其中uDISCO方法的信號(hào)最好


圖4  Volumetric immuno-eprSRS imaging with uDISCO clearing.
a, Volume-rendered image of NeuN (granular neurons) labeled with C-cored MARS2228 in 500-μm-thick cerebellum sections cleared by uDISCO. Single-plane images show good epr-SRS contrast along the whole depth. b, One-shot eight-target volume-rendered images of a 500-μm-thick mouse cerebellum section by RADIANT. A typical workflow for tissue sample preparation, staining and clearing is depicted; Ab, antibody. Fluorescence: LEL (Lycopersicon esculentum lectin DyLight 488), TO-PRO-3 (TO-PRO; cell nucleus stain); epr-SRS: NeuN (MARS2228), TUBB3 (MARS2200), MBP (MARS2176), GABBR2 (MARS2145), WGA (MARS2242) and GFAP (MARS2159). c, Representative single-plane images with zoom-in images at z = 250 μm from the 3D data set in b; scale bars, 100 μm.

研究者還測(cè)試了不同的組織透明化方法 scale S、FOCM、Ce3D、3DISCO、 uDISCO等方法對(duì)于40-100μm厚組織切片的成像效果，發(fā)現(xiàn)uDISCO的成像效果最好（圖3）。并且一次對(duì)8種目標(biāo)（6種MARS探針和兩種熒光）進(jìn)行了同時(shí)成像（圖4b）。

研究者還發(fā)現(xiàn)了透明化組織SRS成像最重要的影響因素，就是MARS探針在透明液中會(huì)產(chǎn)生降解。因此減少其降解，例如降溫到4度或者在透明液中加入DPE和VIT E等還原劑就可以提高成像效果。研究者對(duì)一系列透明化方法進(jìn)行了優(yōu)化和篩選，最終發(fā)現(xiàn)BABB-D4+1%PG在4度下成像的效果最佳，并將這種方法命名為rDISCO （Raman 3D imaging of solvent -cleared organs）。在100μm的組織中，rDISCO成像的信噪比是uDISCO的2.6倍。


圖5 Volume-rendered images of GFAP (astrocytes, labeled with MARS2145) and MBP (oligodendrocytes, labeled with Alexa Fluor 488) in 1-mm-thick cerebellum sections cleared by rDISCO. Two-color merged single-plane images show good epr-SRS and fluorescence contrast along the whole depth. g, Zoomed-in, volume-rendered images of GFAP (labeled with MARS2145) in 1-mm-thick cerebellum sections cleared by rDISCO. h, Single-plane images of g at 500-μm depth show fine spatial resolution to resolve fibral structures of astrocytes .Left, zoom-in to the regions outlined by the dashed white box.1-mm-thick samples (n = 3 ROIs).

用這種方法在1mm厚的腦片上實(shí)現(xiàn)了11個(gè)靶標(biāo)的3D大樣本深度成像，如圖6。


圖6 RADIANT with rDISCO clearing enables millimeter-scale, highly multiplexed protein imaging.
Eleven-target volume-endered images of a 1-mm-thick mouse cerebellum section by RADIANT with rDISCO clearing. Fluorescence: concanavalin A (ConA, Alexa Fluor 350), Griffonia simplicifolia lectin (GS-II, Alexa Fluor 488), TUBB3 (Alexa Fluor 594, direct immunolabeling), TO-PRO (cell nucleus stain); epr-SRS: NeuN (MARS2228), LEL(MARS2200), MBP (MARS2176), GABBR2 (MARS2145), WGA (MARS2242), vimentin (Vim, MARS2212) and GFAP (MARS2159).
 
這項(xiàng)研究結(jié)合了電子預(yù)共振光譜（electronic pre resonance spectroscopy）和受激拉曼顯微技術(shù)（Stimulated Ramen Scattering microscopy），利用特殊設(shè)計(jì)的MARS探針和優(yōu)化的組織透明化方法實(shí)現(xiàn)了在1mm腦片的11種靶標(biāo)的一次性成像。這項(xiàng)技術(shù)在未來的生物醫(yī)學(xué)上會(huì)有非常廣闊的應(yīng)用前景。

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參考文獻(xiàn)：
Lixue Shi et al. Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing, Nature Biotechnology. https://doi.org/10.1038/ s41587-021-01041-z.
 
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