本文作者：黃春筱 博士

同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院

     1.脊髓 CPG與斑馬魚(yú)模型

人和動(dòng)物的行走、奔跑、游泳、爬行等運(yùn)動(dòng)行為被稱(chēng)為脊髓軀體運(yùn)動(dòng)，控制脊髓軀體運(yùn)動(dòng)的神經(jīng)中樞被稱(chēng)為 “脊髓中央模式產(chǎn)生器 (Spinal Central Pattern Generator, 脊髓 CPG)”

圖1：脊髓中央模式產(chǎn)生器的作用（圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)）

車(chē)禍、自然災(zāi)害等造成的嚴(yán)重外傷極易引發(fā)脊髓損傷，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)等多種功能障礙，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及平均壽命，給其家庭和社會(huì)帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前臨床針對(duì)脊髓損傷的治療，依然是固定和康復(fù)治療，無(wú)法做到有效根治。

圖2：脊髓損傷（圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)）

因此，聚焦于脊髓損傷后的神經(jīng)生長(zhǎng)和環(huán)路重建的療法，則有望為上述患者提供更優(yōu)的治療方案。

相較于成年鼠等哺乳動(dòng)物脊髓再生修復(fù)能力低下，成年斑馬魚(yú)脊髓再生能力強(qiáng)，損傷后4-6周便可以恢復(fù)運(yùn)動(dòng)功能，是研究脊髓內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制的好模型。

圖3：用于脊髓損傷研究的斑馬魚(yú)模型（圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)）

通過(guò)斑馬魚(yú)神經(jīng)系統(tǒng)再生和脊髓損傷后修復(fù)的研究，可以使人們了解控制脊髓CPG中間神經(jīng)元軸突再生和脊髓橫斷后局部CPG重連的內(nèi)在機(jī)制。
 

     2.脊髓損傷后的軸突再生和功能恢復(fù)

2021年12月7日，同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院 宋建人教授，在Nature Communications雜志上在線(xiàn)發(fā)表了研究長(zhǎng)文“An injury-induced serotonergic neuron subpopulation contributes to axon regrowth and function restoration after spinal cord injury in zebrafish”（一類(lèi)脊髓損傷后誘導(dǎo)形成的5-HT神經(jīng)元亞群有助于斑馬魚(yú)脊髓損傷后的軸突再生和功能恢復(fù)）。

該研究利用斑馬魚(yú)脊髓雙切斷損傷模型，在損傷部位成功發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)特定的5-HT神經(jīng)元亞群，該群神經(jīng)元細(xì)胞，只在脊髓損傷部分形成，并不受上游5-HT神經(jīng)元的影響。在斑馬魚(yú)脊髓損傷后的軸突再生和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)中起到重要作用。
在該研究中，研究人員使用了脊髓雙切斷模型，在不同時(shí)間分別切斷了斑馬魚(yú)的第7和第12節(jié)脊髓，用于觀(guān)察脊髓損傷后神經(jīng)元再生情況。
研究人員借助于Tg(tph2:GFP)轉(zhuǎn)基因系，其神經(jīng)元表達(dá)GFP分子，且其中97%的神經(jīng)元表達(dá)血清素。將RD注射于損傷遠(yuǎn)端部位，通過(guò)逆向標(biāo)記來(lái)量化軸突再生相關(guān)脊髓中間神經(jīng)元的變化（圖4），結(jié)果顯示斑馬魚(yú)脊髓損傷后再生的脊髓中間神經(jīng)元，是固有的脊髓內(nèi)的反應(yīng)，與上游神經(jīng)元無(wú)關(guān)。

圖4 免疫組化成像顯示雙切斷斑馬魚(yú)模型在不同的時(shí)間后脊髓中間神經(jīng)元恢復(fù)情況

（該圖由Olympus FV3000拍攝得到）

 

利用Tg(tph2:Gal4;UAS:nfsB-mCherry)轉(zhuǎn)基因系（圖5），進(jìn)一步驗(yàn)證了脊髓損傷后誘導(dǎo)形成的單獨(dú)脊髓中間神經(jīng)元即可促進(jìn)神經(jīng)軸突的再生、神經(jīng)環(huán)路重建及運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。

圖5 免疫組化成像顯示雙切斷斑馬魚(yú)模型在有/無(wú)MTZ干預(yù)下脊髓中間神經(jīng)元恢復(fù)情況

（該圖由Olympus FV3000拍攝得到）

研究人員利用Tg(vglut2a:Gal4;UAS:GFP) 和Tg(glyt2:GFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系，對(duì)脊髓損傷后軸突再生的興奮性中間神經(jīng)元和抑制性中間神經(jīng)元比例進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)80%軸突再生的神經(jīng)元是興奮性中間神經(jīng)元（圖6）。

圖6 免疫組化成像顯示脊髓損傷后軸突再生的興奮性中間神經(jīng)元和抑制性中間神經(jīng)元恢復(fù)情況

（該圖由Olympus FV3000拍攝得到）

脊髓損傷誘導(dǎo)形成的脊髓中間神經(jīng)元具有成熟神經(jīng)元細(xì)胞的特性，但是又有著與損傷部位遠(yuǎn)端神經(jīng)元細(xì)胞不同的電位表現(xiàn)和鈣離子濃度變化情況，因此這是一群與非損傷脊髓部位內(nèi)神經(jīng)元不同類(lèi)型的細(xì)胞。

再生的脊髓中間神經(jīng)元被損傷部位遠(yuǎn)端神經(jīng)元軸突包裹纏繞，表現(xiàn)出更活躍的電生理特性，釋放更多的5-HT，從而促進(jìn)軸突再生和環(huán)路重建（圖7）。

圖7 脊髓損傷部位全細(xì)胞膜片鉗記錄電壓變化情況

 

以上研究用充分的數(shù)據(jù)證實(shí)了脊髓內(nèi) 5-羥色胺能系統(tǒng)的局部增強(qiáng)可能具備提供重建哺乳動(dòng)物脊髓運(yùn)動(dòng)回路的潛力。

同時(shí)研究人員證實(shí)5-HT1B 受體在脊髓神經(jīng)修復(fù)中具有重要作用，而損傷誘導(dǎo)后形成的脊髓中間神經(jīng)元也會(huì)是一類(lèi)潛在的治療用細(xì)胞，可以促進(jìn)脊髓 CPG 的重組和脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。

     3.顯微成像的實(shí)驗(yàn)技巧

本研究中，針對(duì)斑馬魚(yú)脊髓的高分辨率宏觀(guān)成像均采用Olympus FV3000共聚焦系統(tǒng)。FV3000優(yōu)異的光路設(shè)計(jì)，支持從1.25倍到150倍等不同放大倍數(shù)的物鏡，特別適合此類(lèi)從宏觀(guān)到微觀(guān)觀(guān)察組織標(biāo)本。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，可先利用低倍物鏡對(duì)整個(gè)組織樣本進(jìn)行快速宏觀(guān)成像，精準(zhǔn)定位感興趣區(qū)域；再切換至高倍物鏡，利用聚焦地形圖（Focus Map）功能，根據(jù)樣品表面高度和厚度在不同區(qū)域設(shè)置最佳焦平面，從而進(jìn)行高分辨率全視野成像或局部感興趣區(qū)域成像，獲得極佳的成像效果。
整套一體化的采集流程，能夠大幅提升科研工作者的實(shí)驗(yàn)效率。

 

參考文獻(xiàn)：

1.https://www.msdmanuals.cn/home/injuries-and-poisoning/spinal-injuries/injuries-of-the-spinal-cord-and-vertebrae

2.Huang, CX., Zhao, Y., Mao, J. et al. An injury-induced serotonergic neuron subpopulation contributes to axon regrowth and function restoration after spinal cord injury in zebrafish. Nat Commun. 12, 7093 (2021).  

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