美國奧古斯塔大學的研究人員通過人類腫瘤組織和小鼠腫瘤模型上的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)成纖維細胞（CAF）是結(jié)直腸癌等腫瘤微環(huán)境中主要的CD73^hi群體。這項成果發(fā)表在《Nature Communications》雜志上，表明結(jié)直腸癌建立了一個交互式檢查點網(wǎng)絡(luò)，以阻止免疫系統(tǒng)攻擊。
 

研究背景
CD73是癌癥免疫治療的新興靶點之一。它是一種常見的免疫檢查點，可將激活免疫反應(yīng)的ATP轉(zhuǎn)化為抑制免疫反應(yīng)的腺苷（ADO），從而抑制免疫反應(yīng)。以往的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中的CD73水平升高與不良臨床結(jié)局有關(guān)。然而，腫瘤微環(huán)境中CD73活性的主要來源仍未明確，具體機制也不清楚。

CAF來源于正常的成纖維細胞，包括組織內(nèi)的成纖維細胞和骨髓來源的間充質(zhì)干細胞（MSC）。CD73已經(jīng)被用作于MSC標記物之一，故需檢測CD73在CAF上的表達，以及CAF-CD73在TME中是否有強制免疫檢查點通路。

研究材料
C57BL/6小鼠，CD73^null (B6.129S1-Nt5e^tm1Lft/J)小鼠，GFP-Tg (C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J)小鼠, A_2B^null (B6.129P2-Adora2b^tm1Till/J)小鼠，E.G7-OVA細胞，mc-38細胞，C57BL/6小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（購于賽業(yè)OriCell，貨號MUBMX-01001），人類大腸癌臨床標本等。

研究路線
1.分析人結(jié)直腸癌（CRC）標本，發(fā)現(xiàn)CD73高表達是人類CRC-CAF的獨特特征。

2.對已發(fā)表的結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集進行主成分分析，研究人類結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中的CD73高水平表達與CAF豐度、免疫抑制增強和預后不良之間的關(guān)系。

3.進行雙向骨髓移植研究EG7腫瘤微環(huán)境中的CD73失活對腫瘤的影響。

4.通過在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)EG7-CAF和MSC，分析CAF-CD73上調(diào)的分子機制。

研究結(jié)果
CAF是CD73活性的主要來源
研究人員首先分析了多份人結(jié)直腸癌（CRC）標本，以分析腫瘤相關(guān)成纖維細胞中的CD73表達。他們發(fā)現(xiàn)，CD73蛋白表達高度集中在成纖維細胞基質(zhì)或腫瘤相關(guān)成纖維細胞上。多個數(shù)據(jù)集的比對分析表明，CD73高表達是人類CRC-CAF的獨特特征。

之后，他們對已發(fā)表的結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集進行主成分分析，發(fā)現(xiàn)CD73表達與CAF豐度之間存在正相關(guān)。重要的是，557名患者的NT5E（CD73編碼基因）高表達與較差的臨床結(jié)局相關(guān)。這些結(jié)果表明，人類結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中的CD73高水平表達與CAF豐度、免疫抑制增強和預后不良呈正相關(guān)（圖1）。
 

圖1. CD73高水平表達與CAF豐度和預后不良相關(guān)

他們接著使用了小鼠EG7 T淋巴瘤模型，發(fā)現(xiàn)EG7-CAF與人類CRC-CAF相似，代表了獨特的CD73^hi/+群體，在腫瘤微環(huán)境中形成廣泛網(wǎng)絡(luò)。接下來，研究人員又分析了CD73活性對腫瘤生長的影響。他們比較了Cd73^null和WT小鼠的EG7 T淋巴瘤進展，發(fā)現(xiàn)Cd73^null小鼠的腫瘤進展受阻，而WT小鼠則進展迅速。

為了驗證CAF-CD73的貢獻，他們后續(xù)開展了雙向的骨髓移植，將WT或Cd73^null小鼠的骨髓移植到致死劑量輻照的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠中，再將GFP轉(zhuǎn)基因小鼠或Cd73^null小鼠的骨髓移植到輻照的Cd73^null小鼠中，并在2個月后接種EG7腫瘤。值得注意的是，接受WT或Cd73^null骨髓的Cd73^null小鼠經(jīng)歷了腫瘤完全消退（圖2）。后續(xù)分析表明，Cd73^null CAF無法產(chǎn)生腺苷，就無法抑制T細胞的活化和增殖。因此，EG7腫瘤微環(huán)境中的CD73失活可導致抗腫瘤免疫增強和隨之而來的腫瘤消退。
 

圖2. CD73失活可導致腫瘤消退

CAF-CD73上調(diào)的機制分析
研究人員還分析了不同大小的EG7腫瘤，發(fā)現(xiàn)腫瘤越大，CAF越多，而CD73水平也隨之增加。為了闡明CAF-CD73上調(diào)的分子機制，他們首先在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)EG7-CAF和MSC，發(fā)現(xiàn)Nt5e mRNA和細胞表面CD73的表達均未升高。隨后在腺苷存在的情況下培養(yǎng)CAF，發(fā)現(xiàn)Nt5e的表達顯著提高。

不同亞型的腺苷受體是組成型的，但在不同組織中差異表達。RNA-seq分析結(jié)果表明，Adora2a (A_2a)和Adora2b (A_2b)是成纖維細胞基質(zhì)中表達的主要亞型。qRT-PCR分析則表明，T細胞主要表達A_2a，而CAF和MSC優(yōu)先表達A_2b。他們還發(fā)現(xiàn)，A_2B拮抗劑而不是A_2A拮抗劑能阻止腺苷誘導的CD73上調(diào)。實驗中使用的MSC由賽業(yè)OriCell^®提供。

研究人員發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤及其CAF的生長，腫瘤中會發(fā)生自然細胞死亡。高水平CD73很容易將垂死的腫瘤細胞釋放的ATP轉(zhuǎn)化為腺苷，而腺苷通過激活免疫細胞上表達的A_2A受體來抑制免疫反應(yīng)。與此同時，腺苷還激活了另一種CAF上表達的受體A_2B，并促使CAF產(chǎn)生更多的CD73。他們認為，盡管A_2A和A_2B都是腺苷受體，但它們并不是冗余的，因為它們在抑制免疫反應(yīng)方面的作用不同。

進一步的分析發(fā)現(xiàn)，在EG7荷瘤小鼠中，A_2A拮抗劑ZM241385、A_2B拮抗劑PSB1115和CD73中和抗體的結(jié)合使用顯著抑制了腫瘤進展，導致一些小鼠中的腫瘤完全消退（圖3）。這表明，阻斷腫瘤微環(huán)境中A_2A、A_2B和CD73的非冗余功能可最大程度逆轉(zhuǎn)免疫抑制。
 

圖3. CD73中和結(jié)合A_2A和A_2B拮抗劑可導致腫瘤消退

總結(jié)
總的來說，這項研究揭示了CAF的一種之前未發(fā)現(xiàn)的免疫抑制功能。這種CAF-CD73^hi狀態(tài)在腫瘤進展和治療過程中被動態(tài)調(diào)控和加強。研究人員認為，從治療的角度來看，應(yīng)考慮同時阻斷CAF-A_2B-CD73回路和ADO-A_2A依賴的免疫抑制，從而實現(xiàn)持久的腫瘤控制。

原文檢索
Yu, M., Guo, G., Huang, L. et al. CD73 on cancer-associated fibroblasts enhanced by the A2B-mediated feedforward circuit enforces an immune checkpoint. Nat Commun 11, 515 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-019-14060-x

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