圖1.  CAR-T細(xì)胞療法的局限性^[1]。A. 抗原逃逸；B. 脫靶效應(yīng)；C. CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及浸潤；D. 免疫抑制微環(huán)境；E. CAR-T細(xì)胞相關(guān)的毒性。

CAR分子結(jié)構(gòu)
CAR-T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的原理是：1.CAR分子的胞外抗原結(jié)合域特異性識別腫瘤抗原；2.識別信號傳導(dǎo)至CAR分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；3.胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域活化T細(xì)胞，使細(xì)胞增殖、合成穿孔素和顆粒酶、釋放細(xì)胞因子等，殺傷腫瘤細(xì)胞。為了最大程度地發(fā)揮以上功能，CAR分子的結(jié)構(gòu)設(shè)計是至關(guān)重要的。

CAR分子由4個主要成分構(gòu)成：
1. 細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域：賦予CAR分子靶點特異性的功能。它的原理是將抗體的可變重鏈（V_H）和可變輕鏈（V_L）連接形成單鏈可變區(qū)段（scFv），用以特異性識別腫瘤表面抗原。

2. 鉸鏈區(qū)：連接跨膜域和細(xì)胞外單元的結(jié)構(gòu)區(qū)。鉸鏈的作用是提供空間靈活性，可以克服空間位阻，并且擁有合適的長度允許抗原結(jié)合域接近目標(biāo)表位^[1]。

3. 跨膜結(jié)構(gòu)域：主要功能是將CAR分子錨定在T細(xì)胞的細(xì)胞膜上。有研究表明，跨膜區(qū)可能影響CAR分子的表達(dá)水平、穩(wěn)定性，在信號傳導(dǎo)中發(fā)揮作用^[2][3][4]。

4. 細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域：CAR分子共刺激的效果是CAR工程中備受關(guān)注的焦點。1-3代CAR分子的主要區(qū)別來自于胞內(nèi)的共刺激結(jié)構(gòu)域。兩種最常見的、經(jīng)由FDA批準(zhǔn)的共刺激域CD28和4-1BB都具有高效的活化T細(xì)胞的效果，可誘導(dǎo)T細(xì)胞執(zhí)行不同的功能^[5]。
 

圖2. CAR分子設(shè)計藍(lán)圖^[20]。

CAR-T細(xì)胞治療實體瘤的挑戰(zhàn)
1●腫瘤抗原異質(zhì)性
腫瘤抗原異質(zhì)性是CAR-T細(xì)胞療法對抗實體瘤的障礙之一。腫瘤抗原主要分為兩種：腫瘤相關(guān)抗原（TAA）和腫瘤特異性抗原（TSA）：TAA在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，在正常組織細(xì)胞中也有表達(dá)，但表達(dá)量較低；TSA僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，不在正常組織細(xì)胞中表達(dá)，因此也是最理想的抗原靶點。由于TSA的發(fā)現(xiàn)和篩選極為困難，CAR分子最常用的識別靶點是TAA，因此不同類型腫瘤細(xì)胞對于TAA的多樣性表達(dá)可能會影響CAR-T細(xì)胞對癌細(xì)胞的識別，并降低CAR-T治療的效果。

目前已經(jīng)有多種方法使CAR-T細(xì)胞靶向識別多種腫瘤相關(guān)抗原，例如在單一的T細(xì)胞上共表達(dá)多種CAR分子、可編程式的CAR表達(dá)調(diào)控等。表達(dá)兩個或多個抗原識別結(jié)構(gòu)域，可以使單個CAR-T細(xì)胞識別腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的多個抗原，從而消除抗原異質(zhì)性帶來的不利影響。
 

圖3. 實體瘤中的免疫抑制微環(huán)境^[13]。a. 效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞；b. 免疫抑制細(xì)胞和細(xì)胞因子；c. 物理屏障；d. 腫瘤內(nèi)部微環(huán)境；e. 其他免疫抑制因素

2●CAR-T細(xì)胞的回輸和對腫瘤組織的浸潤
CAR-T細(xì)胞可以存在于血液和淋巴系統(tǒng)中，因此對于血液瘤，CAR-T細(xì)胞具有更多的機(jī)會和血液腫瘤細(xì)胞接觸^[1]，而在實體瘤中，CAR-T細(xì)胞較難通過血液系統(tǒng)穿透腫瘤組織^[6]。此外，由于缺乏參與T細(xì)胞滲透到腫瘤組織中的趨化因子表達(dá)，以及實體瘤中存在致密的纖維化基質(zhì)，導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞遷移和侵入腫瘤細(xì)胞的能力降低^[7]。

在很多報道中已有將CAR-T細(xì)胞直接局部注入到腫瘤位點（Tumor site）中的方法，比如腦部^[8]、乳腺^[9]、胸膜^[10]、肝臟等^[11]。CAR-T細(xì)胞的局部注射也可能降低脫靶效應(yīng)帶來的風(fēng)險。然而，許多實體瘤具有轉(zhuǎn)移性，是局部注射CAR-T細(xì)胞的一大難點。另一方面，一些臨床研究中使用趨化因子介導(dǎo)CAR-T細(xì)胞的運(yùn)輸，增強(qiáng)對腫瘤的定位。例如巨噬細(xì)胞集落刺激因子1受體 (CSF-1R) 在CAR-T 細(xì)胞中的表達(dá)使這些細(xì)胞對CSF-1（一種在許多實體瘤中富集的單核細(xì)胞趨化因子）產(chǎn)生反應(yīng)，在增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞增殖信號傳導(dǎo)的同時，不影響細(xì)胞的殺傷毒性^[12]。

實體瘤的腫瘤微環(huán)境在促進(jìn)腫瘤生長和增殖的同時，對CAR-T細(xì)胞造成了免疫抑制。包括免疫抑制細(xì)胞如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）、髓源抑制細(xì)胞（MDSC）、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）^[13]，實體瘤中產(chǎn)生的生長因子、局部細(xì)胞因子，CTLA-4和PD-1等免疫檢查點分子等，這些復(fù)合環(huán)境下的腫瘤微環(huán)境會極大地限制CAR-T細(xì)胞的療效。

在Burga等人的研究中^[14]，使用基因工程產(chǎn)生的Gr-1抗體耗竭髓源抑制細(xì)胞（MDSC）在小鼠實驗中提高了CAR-T的腫瘤殺傷效果。也有報道通過構(gòu)建分泌ECM降解酶的CAR-T細(xì)胞來打破實體瘤中的物理屏障^[15]。

CAR-T細(xì)胞治療實體瘤的進(jìn)展
近年來，針對實體瘤靶點的研究開始逐漸增多，已有相當(dāng)一部分的研究進(jìn)入到了臨床Ⅱ期階段。表1列舉了一些常見的實體瘤靶點以及適應(yīng)癥。

表1. 實體瘤常見靶點及適應(yīng)癥（臨床數(shù)據(jù)來源于ClinicalTrails.org）。

已有報道稱，卵巢癌表面高表達(dá)的腫瘤相關(guān)糖蛋白72（TAG72）被用作 CAR-T 細(xì)胞治療的靶點^[16]。該研究構(gòu)建了第二代TAG72-BBζ CAR分子，結(jié)果顯示CAR-T細(xì)胞經(jīng)局部腹膜內(nèi)遞送表現(xiàn)出有效的抗腫瘤活性，并延長了卵巢癌腹水小鼠的生存期。也有研究表明使用MUC16或HER2構(gòu)建的CAR分子具有腫瘤靶向性，抑制卵巢癌細(xì)胞的生長和增殖。間皮素（Mesothelin）是一種細(xì)胞表面糖蛋白，已被證明在多種癌癥細(xì)胞中高表達(dá)。

在肝癌治療中，CAR-T細(xì)胞療法的研究剛剛起步�；�于CAR-T細(xì)胞的癌胚抗原（CEA）、Glypican-3、粘蛋白-1等靶點的研究已經(jīng)在肝癌治療中取得了一定的效果。將 Glypican-3 (GPC3) 抗體與CAR-T療法聯(lián)合使用可能是治療肝臟惡性腫瘤的有效方法^[21]。

在肺癌的研究中，用受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1特異性(ROR1)-CAR-T細(xì)胞治療肺癌A549細(xì)胞系，表明其具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性^[18]。而Srivastava及其同事在發(fā)現(xiàn)ROR1 CAR-T細(xì)胞浸潤性較差并且功能性失調(diào)后，使用奧沙利鉑/環(huán)磷酰胺（Ox/Cy ）化療預(yù)處理，改善了CAR-T細(xì)胞向腫瘤的遷移，并且這種方案配合抗PD-L1檢查點阻斷劑，可以提高生存率^[19]。此外，也有其他報道證實基于CAR-T細(xì)胞的間皮素 、產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素的肝細(xì)胞癌A2(EphA2)，以及PSCA和mucin-1也是肺癌的理想治療靶點。
 

圖5. 聯(lián)合Ox/Cy 化療預(yù)處理的CAR-T細(xì)胞療法^[19]。

CAR-T細(xì)胞療法為血液瘤患者帶來了希望，尤其是在晚期惡性腫瘤中，擁有不錯的前景。然而，腫瘤微環(huán)境的免疫抑制、物理屏障、抗原異質(zhì)性等因素阻礙了CAR-T細(xì)胞在實體瘤中的療效，還有待進(jìn)一步突破性進(jìn)展。研究者們?yōu)榱藨?yīng)對這些挑戰(zhàn)已經(jīng)做了很多準(zhǔn)備和具有前瞻性的工作。新穎的想法和創(chuàng)造性的CAR工程設(shè)計不斷迭代與更新，我們也期待著針對實體瘤CAR-T治療的完美解決方案。

賽業(yè)生物基于多年在腫瘤免疫領(lǐng)域的研究經(jīng)驗，可為CAR-T及其它細(xì)胞治療研究者提供從CAR病毒制備、腫瘤免疫細(xì)胞與動物模型的構(gòu)建，到體內(nèi)體外藥效評價的全流程服務(wù)，更好地加速CAR-T及細(xì)胞治療研發(fā)進(jìn)程。

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