突破丨超快低光毒60nm超高分辨活細(xì)胞成像

李浩宇/陳良怡團(tuán)隊(duì) 合作發(fā)明計(jì)算超分辨圖像重建算法，穩(wěn)定提升熒光顯微鏡2倍分辨率

本文作者：北京大學(xué) 杜珂 博士

2021年11月16日，哈爾濱工業(yè)大學(xué) 李浩宇教授（超視計(jì)首席專家）團(tuán)隊(duì)與 北京大學(xué) 陳良怡教授（超視計(jì)首席科學(xué)家）團(tuán)隊(duì)合作，以封面論文的形式在 Nature Biotechnology 上發(fā)表Sparse deconvolution improves the resolution of live-cell super-resolution fluorescence microscopy【1】。

這篇文章提出了 稀疏解卷積（Sparse deconvolution）方法，可突破現(xiàn)有熒光顯微系統(tǒng)的光學(xué)硬件限制，首次實(shí)現(xiàn)通用計(jì)算熒光超分辨率成像，可提供目前活細(xì)胞光學(xué)成像中超高空間分辨率（60nm）下，速度更快（564Hz）、成像時(shí)間更長(zhǎng)（1小時(shí)以上）的超分辨成像。

稀疏解卷積（Sparse deconvolution）是基于“熒光圖像的分辨率提高等價(jià)于圖像的相對(duì)稀疏性增加”這個(gè)通用先驗(yàn)知識(shí)，結(jié)合陳良怡教授團(tuán)隊(duì)在2018年Nature Biotechnology文章中提出的信號(hào)空時(shí)連續(xù)性先驗(yàn)知識(shí)【2】而發(fā)明的兩步迭代解卷積算法。

稀疏解卷積（Sparse deconvolution）的出現(xiàn)，打破了基于光學(xué)硬件或者熒光探針的改進(jìn)無(wú)法進(jìn)一步提升活細(xì)胞時(shí)空分辨率的僵局。

  【活細(xì)胞超分辨成像小知識(shí)】  

2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了熒光超分辨顯微技術(shù)，利用熒光分子的化學(xué)開(kāi)關(guān)特性（PALM/FPALM/STORM）或者物理的直接受激輻射現(xiàn)象（STED），實(shí)現(xiàn)超越衍射極限的超分辨成像。盡管如此，活細(xì)胞中的超分辨率成像仍然存在兩個(gè)主要瓶頸：

（1）超分辨率的光毒性限制了觀察活細(xì)胞中精細(xì)生理過(guò)程；

（2）受限于熒光分子單位時(shí)間內(nèi)發(fā)出的光子數(shù)，時(shí)間和空間分辨率不可兼得。

受限于這個(gè)瓶頸，為了在活細(xì)胞上達(dá)到60 nm空間分辨率極限，現(xiàn)有超分辨率成像手段需要強(qiáng)照明功率（kW~MW/mm2）、特殊熒光探針和長(zhǎng)曝光時(shí)間（> 2 s）。強(qiáng)照明功率引起的強(qiáng)漂白會(huì)破壞真實(shí)熒光結(jié)構(gòu)的完整性，長(zhǎng)曝光時(shí)間在圖像重構(gòu)時(shí)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)偽影，降低有效分辨率。

迄今為止，基于光學(xué)硬件或者熒光探針的改進(jìn)無(wú)法進(jìn)一步提升活細(xì)胞超分辨率的時(shí)空分辨率，實(shí)現(xiàn)毫秒尺度60 nm的時(shí)空分辨率成像。

 

稀疏結(jié)構(gòu)光顯微鏡（Sparse-SIM）的搭建，正是使用了Olympus雙層倒置熒光顯微鏡IX83配合高數(shù)值孔徑（NA）油浸物鏡實(shí)現(xiàn)。

值得一提的是，本次研究【1】與2018年Nature Biotechnology發(fā)表的Hessian SIM文章【2】中，兩篇超高分辨率研究文章均使用了Olympus獨(dú)有的NA值高達(dá)1.7的超高分辨率物鏡APON100XHOTIRF。

  
 

超分辨成像征程的每一步，我們一直風(fēng)雨兼程，與君同行，讓文獻(xiàn)里遙不可及的理論算法，化為您手上披荊斬棘的研究利器。

早在今年7月在全國(guó)生物物理大會(huì)上，奧林巴斯攜手超視計(jì)科技，聯(lián)合發(fā)布了SIM-ultimate轉(zhuǎn)盤(pán)-結(jié)構(gòu)光多模態(tài)超分辨系統(tǒng)（Spinning Disk Confocal and Structured Illumination jointed Super-Resolution Microscope） （點(diǎn)擊此處了解詳情）。SIM-ultimate以?shī)W林巴斯穩(wěn)健、開(kāi)放的轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦系統(tǒng)為平臺(tái)，搭載超視計(jì)超分辨率結(jié)構(gòu)光(SIM)系統(tǒng)，及本次Nature Biotechnology發(fā)表的最新稀疏解卷積（Sparse deconvolution）算法，實(shí)現(xiàn)了空間分辨率可達(dá)60nm的三維、四色、長(zhǎng)時(shí)間的活細(xì)胞超分辨成像，為各種尺度、各種應(yīng)用場(chǎng)景的成像需求提供靈活系統(tǒng)的解決方案。

 

接下來(lái)，我們結(jié)合文章數(shù)據(jù)一起看看搭載了稀疏解卷積（Sparse deconvolution）算法的 SIM-ultimate 可以實(shí)現(xiàn)哪些應(yīng)用呢？

 

     1. 應(yīng)用舉例：DNA折紙標(biāo)準(zhǔn)樣本驗(yàn)證     

為了在已知結(jié)構(gòu)樣本中驗(yàn)證分辨率的提升，研究者設(shè)計(jì)并合成了兩個(gè)熒光標(biāo)記位點(diǎn)的DNA折紙樣本，每個(gè)位點(diǎn)用4~5個(gè)Cy5標(biāo)記。

當(dāng)這些分子間距為60 nm、80 nm和100 nm時(shí)，它們?cè)?SPAN lang=EN-US>TIRF-SIM下幾乎無(wú)法區(qū)分，但在經(jīng)過(guò)稀疏解卷積重建后（Sparse-SIM，圖1）可以很好地區(qū)分它們中間的距離。

整體結(jié)果可以用單分子定位顯微鏡ROSE【3】交叉驗(yàn)證，與Sparse-SIM得到的DNA折紙的熒光對(duì)間距以及不同間距熒光對(duì)在玻片上的分布一致。

圖1：Sparse-SIM解析不同距離DNA折紙樣本。（a）在相同視場(chǎng)下，用配對(duì)Cy5標(biāo)記不同距離（60 nm, 80 nm, 100 nm, 120 nm）的DNA折紙樣品，用TIRF（左）、TIRF-SIM（中）和Sparse-SIM（右）成像。（b）在TIRF、TIRF-SIM和Sparse-SIM下，黃色（60 nm）、藍(lán)色（80 nm）(80 nm)、綠色（100 nm）和紅色（120 nm）框包圍的放大區(qū)域。比例尺：（a）2 μm；（b）100 nm。

 

 

     2. 應(yīng)用舉例：Sparse-SIM超快活細(xì)胞

成像揭示核孔結(jié)構(gòu)和胰島素囊泡早期融合孔道     

在活細(xì)胞成像中，稀疏結(jié)構(gòu)光顯微鏡（Sparse-SIM）可以解析標(biāo)記不同核孔蛋白（Nup35, Nup93, Nup98，或Nup107）的環(huán)狀核孔結(jié)構(gòu)，而它們?cè)趥鹘y(tǒng)結(jié)構(gòu)光顯微鏡（2D-SIM）下形狀大小與100 nm熒光珠類(lèi)似（圖2c, 2d）。由于相機(jī)像素尺寸與孔徑直徑類(lèi)似，測(cè)量的核孔擬合直徑與Sparse-SIM的分辨率相當(dāng)。校正后Nup35和Nup107孔的直徑分別為~66 ± 3 nm和~97 ± 5 nm，而Nup98和Nup93直徑大小處于這個(gè)范圍中（圖2e, 2f），結(jié)果與以前用其他超分辨成像方法在固定細(xì)胞中獲得的直徑相符【4】。有趣的是，12分鐘超分辨成像可以顯示活細(xì)胞中核孔形狀變化，這可能反映了核膜上的單個(gè)核孔復(fù)合物動(dòng)態(tài)重新定向到焦平面或遠(yuǎn)離焦平面（圖2g），這是其他超分辨方法難以觀察到的。

 

 

圖2：Sparse-SIM解析核孔蛋白動(dòng)態(tài)過(guò)程。(c)用Sparse-SIM觀察活COS-7細(xì)胞中以Nup98-GFP標(biāo)記的動(dòng)態(tài)環(huán)狀核孔的典型例子，持續(xù)時(shí)間超過(guò)10分鐘。上下區(qū)域分別顯示2D-SIM和Sparse-SIM下的圖像。(d)比較 (c)中青色框中的核孔結(jié)構(gòu)快照與100 nm熒光珠在不同重建方法(2D-SIM、20次RL解卷積后、50次RL解卷積后、Sparse-SIM）下的結(jié)果。（e）由于核孔的大小與Sparse-SIM的分辨率和像素大小相當(dāng)，按照Supplementary Note 9.1的協(xié)議（詳情請(qǐng)見(jiàn)文章），分別推導(dǎo)出Nup35-GFP（紅色）、Nup98-GFP（黃色）、Nup93-GFP（綠色）和Nup107-GFP（青色）標(biāo)記的核孔結(jié)構(gòu)的實(shí)際直徑。（f）Nup35（66 ± 3 nm, n=30）、Nup98（75 ± 6 nm, n=40）、Nup93（79 ± 4 nm, n = 40）、Nup107（97 ± 5nm ,n = 40）的平均直徑環(huán)。左右兩幅蒙太奇分別為傳統(tǒng)Wiener重構(gòu)或稀疏解卷積后的結(jié)果。（g）在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì) （c）中的品紅色方框放大并顯示。比例尺：（c）500 nm；（d, g, f）100 nm。

 

通過(guò)滾動(dòng)重建，Sparse-SIM的時(shí)間分辨率可達(dá)564Hz，識(shí)別出來(lái)INS-1細(xì)胞中VAMP2-pHluorin標(biāo)記的、更小的胰島素囊泡融合孔道（如~61 nm孔徑）。它們?cè)谀遗萑诤系脑缙诔霈F(xiàn)，孔徑�。ㄆ骄�直徑~87 nm），持續(xù)時(shí)間短（9.5 ms），不能被之前傳統(tǒng)的TIRF-SIM所識(shí)別【2】。另一方面，鑒別出來(lái)的穩(wěn)定融合孔在囊泡融合的后期出現(xiàn)，孔徑大（平均直徑~116 nm），持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)（47 ms），是之前看到的結(jié)構(gòu)【2】。值得一提的是，雖然這里發(fā)現(xiàn)的囊泡早期融合孔狀態(tài)很難被其他的超分辨率成像手段所直接驗(yàn)證，但是它們的發(fā)生頻率與30多年前用快速冷凍蝕刻電子顯微鏡所觀察到的“小的融合孔發(fā)生概率遠(yuǎn)低于大的融合孔”現(xiàn)象相吻合【6】。
     3. 應(yīng)用舉例：稀疏解卷積是提升熒光顯微鏡分辨率的通用方法     與當(dāng)下熱門(mén)的深度學(xué)習(xí)超分辨率顯微重建不同，信號(hào)的空時(shí)連續(xù)性、高空間分辨率導(dǎo)致的熒光圖像相對(duì)稀疏性這兩個(gè)先驗(yàn)知識(shí)，是熒光顯微成像的通用先驗(yàn)知識(shí)，不依賴于樣本的形態(tài)以及特定的熒光顯微鏡種類(lèi)。因此，稀疏解卷積是通用熒光顯微計(jì)算超分辨率成像算法，可被廣泛應(yīng)用于提升其他熒光顯微模態(tài)分辨率，觀察不同種類(lèi)細(xì)胞器的精細(xì)結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)（圖3）。

圖3: 稀疏解卷積廣泛應(yīng)用于提升不同顯微成像模態(tài)空間分辨率，揭示各類(lèi)細(xì)胞器精細(xì)結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)。

比如稀疏解卷積增強(qiáng)的商業(yè)超分辨轉(zhuǎn)盤(pán)共焦結(jié)構(gòu)光顯微鏡（SD-SIM）【7】，可以實(shí)現(xiàn)XY方向90納米nm，Z方向250nm 納米的空間分辨率，清晰記錄分裂期7 μm深度內(nèi)的全細(xì)胞內(nèi)所有線粒體外膜網(wǎng)絡(luò)（圖4）。同樣，若稀疏解卷積增強(qiáng)與商業(yè)SD-SIM結(jié)合，因此，在SIM-ultimate系統(tǒng)上可以很容易實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞上的三維、四色超分辨率成像。

此外，稀疏解卷積還可以與膨脹顯微鏡（ExM）【8】結(jié)合，解析細(xì)胞膨脹后的復(fù)雜結(jié)構(gòu)；也可以與寬場(chǎng)、點(diǎn)掃描的共聚焦、膨脹顯微鏡（ExM）【8】、受激輻射損耗顯微鏡（STED）【9】以及微型化雙光子顯微鏡（FHIRM-TPM 2.0）【10】結(jié)合，實(shí)現(xiàn)近兩倍的空間分辨率提升。因此，稀疏解卷積的提出，將幫助使用各種各樣熒光顯微鏡的生物醫(yī)學(xué)研究者更好地分辨細(xì)胞中的精細(xì)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)。

圖4: Sparse SD-SIM解析活細(xì)胞三維線粒體外膜網(wǎng)絡(luò)。（k）活體COS-7細(xì)胞的線粒體外膜（Tom20-mCherry標(biāo)記）的三維分布，顏色表征深度。（l）SD-SIM原始數(shù)據(jù)與Sparse SD-SIM的水平（左）和垂直（右）的白色框區(qū)域放大展示。比例尺：（k）5 μm；（l）1 μm。

總之，通過(guò)稀疏解卷積算法（Sparse deconvolution）來(lái)實(shí)現(xiàn)計(jì)算熒光超分辨率成像，與目前基于特定物理原理或者特殊熒光探針的超分辨率方法都不相同。與超快結(jié)構(gòu)光超分辨顯微鏡結(jié)合形成的Sparse-SIM是目前活細(xì)胞光學(xué)成像中，分辨率更高（60納米）、速度更快（564幀/秒）、成像時(shí)間更長(zhǎng)（1小時(shí)以上）的超分辨光學(xué)顯微成像手段。

 

 

     4. SIM-ultimate: 摘星攬?jiān)?觸手可得     

 

在生命科學(xué)探索的雄關(guān)漫道中，奧林巴斯一直致力于以百年的深厚積淀，為您的成像研究征程添油助力。SIM-ultimate轉(zhuǎn)盤(pán)-結(jié)構(gòu)光多模態(tài)超分辨系統(tǒng)，以?shī)W林巴斯穩(wěn)健、開(kāi)放的轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦系統(tǒng)為平臺(tái)，搭載超視計(jì)超分辨率結(jié)構(gòu)光（SIM）系統(tǒng)及最新稀疏解卷積（Sparse deconvolution）算法，實(shí)現(xiàn)了共聚焦與結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)兩大超分辨成像技術(shù)的雙劍合璧，實(shí)現(xiàn)了空間分辨率可達(dá)60nm的三維、四色、長(zhǎng)時(shí)間的活細(xì)胞超分辨成像，完美平衡了時(shí)空分辨率、光毒性、成像視野及成像深度各方面的成像需求。SIM-ultimate開(kāi)啟了一種全新的聯(lián)合成像工作模式——joint working模式，基于完全共用的熒光標(biāo)記方式，打通Spinning Disk Confocal、Spinning SR、2D-SIM、TIRF-SIM等成像模式。專注于活細(xì)胞超分辨成像研究，提供多種尺度、多種模態(tài)的成像模式以及稀疏解卷積算法在內(nèi)的多種獨(dú)家超分辨算法，靈活切換，組合出擊，從宏觀到微觀，從結(jié)構(gòu)到動(dòng)態(tài)，分毫必現(xiàn)，無(wú)所不及。

 

哈爾濱工業(yè)大學(xué)博士生趙唯淞、北京大學(xué)博士后趙士群、李柳菊為共同第一作者，哈爾濱工業(yè)大學(xué)儀器科學(xué)與工程學(xué)院李浩宇教授和北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院陳良怡教授為論文共同通訊作者，共同作者還包括哈爾濱工業(yè)大學(xué)譚久彬院士、劉儉教授，北京大學(xué)毛珩博士，生科院成像平臺(tái)單春燕博士和華南師范大學(xué)劉彥梅教授。參與合作的實(shí)驗(yàn)室包括武漢大學(xué)宋保亮教授、北京大學(xué)陳興教授、中科院國(guó)家納米科學(xué)中心丁寶全教授和生物物理所紀(jì)偉教授等。該項(xiàng)工作得到北京大學(xué)膜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、麥戈文腦研究所、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、北京智源人工智能研究院的支持，也是多模態(tài)跨尺度國(guó)家生物醫(yī)學(xué)成像設(shè)施建設(shè)過(guò)程中的重要成果。
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41587-021-01092-2

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